雨生红球藻天然虾青素提取研究进展

虾青素又名虾红素、虾黄质，属于类胡萝卜素衍生物，其分子结构中含有11个共轭双键、2个β-紫罗兰酮环以及羟基[1-2]。虾青素具有很强的抗氧化活性，比β-胡萝卜素、玉米黄质和叶黄素的抗氧化效力高10倍，比维生素E的高100倍[3]。此外，虾青素具有抗衰老、抗炎、抗癌、增强免疫力等功能[4-5]，还可保护中枢神经系统、用于预防和治疗心血管疾病和动脉粥样硬化等[6]。虾青素突出的生物活性使其被广泛应用于食品、化妆品、水产养殖和医药等领域[7-8]。

化学合成和天然提取是获取虾青素的两种主要途径，但二者获取的虾青素在结构、功能、应用及安全等方面存在较大差异，目前商业中95%以上为化学合成虾青素[9]。合成虾青素中3S—3'S结构不超过25%，而天然虾青素中90%以上为3S—3'S结构，因此天然虾青素具有更强的生物活性和更高的生物利用度[10-11]。据报道[12-13]，天然虾青素的抗氧化活性是合成虾青素的90倍，且能与蛋白质或脂质结合，具有更好的稳定性。

雨生红球藻中虾青素的积累量最高可达5%，是天然虾青素的最佳生物来源[10]。孟春晓等[14]综述了雨生红球藻中虾青素提取方法的研究进展，介绍了几种常见虾青素提取方法的效果及优缺点，并指出胁迫环境下提高雨生红球藻中虾青素含量的重要性。赵晓燕等[15]针对雨生红球藻中虾青素的功能、破壁及提取方法的研究进展进行了综述。近年来，随着离子液体(ILs)、低共熔溶剂(DES)等新型溶剂的出现，为虾青素的提取提供了新的技术思路。文章拟介绍天然虾青素的生物来源、功能及应用研究的新进展，对比分析雨生红球藻的不同破壁方法和虾青素的提取方法，重点介绍近期国内外对雨生红球藻虾青素(HP-AX)高效分离提取的新方法，旨在为推动天然虾青素的规模化生产提供依据。

1 天然虾青素的生物来源、功能及应用

与法夫酵母(0.4%)、太平洋磷虾(0.012%)、北极虾(0.12%)等天然来源相比，雨生红球藻中虾青素含量为1%～5%[16]。虾青素在雨生红球藻中的积累量受光照、温度、激素、营养物质和盐影响[17-18]。虾青素的共轭双键、酮基和羟基使其具有多种生理功能[2, 11]。在食品和医药领域利用虾青素抗氧化、抗炎等功效制备功能食品与药物[19-20]，而虾青素的抗氧化、抗衰老和防止皮肤损伤的功能可以达到美容养颜和保水保湿的效果[21-22]。此外，虾青素与肌红蛋白结合，赋予水产动物诱人的红色及色素沉着能力，在水产养殖和饲料业中被广泛应用[23]。HP-AX突出的生物功能可能与以下3个特性有关[24]：① 95.7%以酯化形式存在；② 3S-3'S是主要的立体异构体；③ 存在少量叶黄素、β-胡萝卜素、玉米黄质等辅助类胡萝卜素。

Davinelli等[25]对虾青素的安全性及生物利用度进行了论述，并指出HP-AX作为一种安全的添加剂被允许添加至动物饲料中的剂量逐渐增大，且在多种动物及人体中均具有较好的生物吸收利用率。Brendler等[26]综述了虾青素的安全性，介绍了向FDA递交申请作为新食品成分的虾青素均来源于雨生红球藻。上述研究表明，HP-AX作为一种安全的虾青素来源，其需求量不断增长且应用范围不断增大，从雨生红球藻中高效提取虾青素具有重要意义。

2 雨生红球藻的破壁方法

雨生红球藻壁厚1.8～2.3 μm，其成熟红细胞壁是由海藻素、甘露聚糖和纤维素及异质多糖组成的三层结构[11,27]。这种刚性细胞壁结构严重阻碍了提取溶剂向细胞内渗透，增加了虾青素提取的难度。因此，破壁处理是提取虾青素的必要手段。常用于雨生红球藻壁破碎的方法有物理、化学和生物法。表1列举并比较了在不同破壁、提取方法下获得的HP-AX提取率。

2.1 物理破壁法

研磨法、冻融温差法、超声法、高压匀浆法依靠作用过程中产生的机械力、超声波效应、碰撞挤压效应等破坏细胞壁，是雨生红球藻破壁的常用方法[15,37]。赵晓燕等[15]列举并比较了以上几种常用物理破壁法对HP-AX提取率的影响，发现研磨和超声处理效果较好，但虾青素提取率不超过4%。孟昂等[38]用液氮研磨破坏雨生红球藻壁，以200 W超声辅助乙酸乙酯—乙醇(1∶2，体积比)在料液比9∶50 (mL/mg)和39 ℃条件下处理雨生红球藻后，将其置于40 ℃水浴震荡20 min，所得HP-AX提取率为85.1%。高压脉冲电场是一种新型的破壁方法，利用高压电流改变细胞的通透性，使胞内化合物选择性释放。Martinez等[27]以乙醇为提取溶剂，对雨生红球藻施加1 kV/cm的电场预处理6 h比采用研磨和超声预处理的提高了20%。该方法产生的能量适中，不会引起产品温度升高而导致热敏性活性物质变性，利于保持虾青素的稳定性和生物活性，但耗时较长。

物理破壁法引起的原料成分损失较少，但单独使用破壁效果不佳，为获得较高的虾青素提取率往往需与化学溶剂协同作用。此外，物理破壁协同溶剂一步提取是实现短时高效提取HP-AX需重点关注的问题。

2.2 化学破壁法

化学破壁法是利用溶剂与雨生红球藻壁间的化学作用使细胞破损，无机酸、有机溶剂和ILs是常用的破壁试剂。任晓丽等[39]利用硫酸在60 ℃下破坏雨生红球藻壁纤维素和蛋白质分子间的化学键，发现虾青素提取量比对照组提高了近45倍。吴世林等[28]利用二甲基亚砜和乙醇有效结合研磨法使雨生红球藻破壁率高达99%。化学破壁法与物理破壁法结合使用能有效破坏雨生红球藻壁，且该方法简单、易操作、对设备要求低。然而，无机酸和有机溶剂容易对虾青素造成化学污染。

ILs是由阴、阳离子组成的一种低温熔融盐，不同阴、阳离子形成的ILs显示出不同的极性，但极性大的ILs对纤维素等多糖物质具有较高溶解度，利于破坏和穿透雨生红球藻壁。Desai等[40]研究发现，1-乙基-3甲基咪唑磷酸二丁基酯([Emim]DBP)的阴、阳离子通过与细胞壁甘露聚糖的氢键作用，使雨生红球藻细胞周围形成一层糖膜，因此渗透或削弱细胞壁，获得了较高的虾青素提取率(77%)。Choi等[31]发现1-乙基-3-甲基咪唑硫酸氢盐([Emim]HSO4)、1-乙基-3-甲基咪唑对甲苯磺酸盐([Emim]CH3SO3)、1-乙基-3-甲基咪唑双(三氟甲基磺酰基)酰亚胺([Emim](CF3SO2)2N)等多种ILs可以有效撕裂、破坏雨生红球藻壁，从而提高虾青素提取率(86%～99%)，其破壁前后的细胞形貌如图1所示。此外，Liu等[41]指出，由于咪唑类ILs有效破坏纤维素分子的氢键，其对雨生红球藻壁的破坏程度高于含吡啶和铵基阳离子的离子液体。ILs破壁法具有温和、有效的优点，但能高效破坏雨生红球藻壁的ILs局限于咪唑类，其价格显著高于铵基类ILs。

2.3 生物酶法破壁

纤维素复合酶、果胶酶和蛋白酶等通过破坏雨生红球藻壁的纤维素、多糖、蛋白质的氢键、糖苷键及肽键，从而导致细胞壁破裂和胞内物质流出。酶解法破壁率通常为70%左右[15]。余绍蕾等[42]用0.5%复合纤维素酶在45 ℃酶解雨生红球藻5 h，随后在40 MPa压力下均质2次，将破壁率提高至95%以上，比单独使用高压均质的破壁率高18.07%。然而，酶法成本高、耗时长并存在的酶变性问题制约了其应用。

3 虾青素的提取方法

雨生红球藻经破壁后，HP-AX的提取方法主要包括油溶提取、化学试剂提取、超临界提取、双水相提取、酶解辅助提取等。

3.1 油溶法

常用于HP-AX提取的天然植物油有橄榄油、大豆油、玉米油和葡萄籽油。Kang等[33]证明，常温下不同植物油对HP-AX提取率的顺序为橄榄油(93.9%)> 大豆油(91.7%)> 玉米油(89.3%)> 葡萄籽油(87.5%)。江燕等[43]发现天然植物油中含有油酸、亚油酸、棕榈酸等大量不饱和脂肪酸(PUFA)，且PUFA含量为葡萄籽油>橄榄油>大豆油>玉米油。据此推测，PUFA的不饱和键与末端羧基结构可能为雨生红球藻壁多糖、蛋白质及虾青素提供结合位点。因此，橄榄油对未破壁HP-AX提取率较高，但葡萄籽油的HP-AX提取率却最低，其组分对虾青素提取的抑制作用需进一步研究。油溶法具有安全无毒、简便、有效的优点，但提取时间长且虾青素与高沸点油的难分离性增加了分离成本。

3.2 化学试剂提取法

3.2.1 有机溶剂虾青素属于脂溶性物质且带有羟基、羰基等极性基团，因此溶剂的极性与虾青素溶解能力密切相关，且极性大的有机溶剂更容易渗透雨生红球藻壁。赵晓燕等[15]指出虾青素在有机溶剂中的溶解度随溶剂极性的增加而减小。王红霞等[44]研究发现，20 ℃、2 h下不同溶剂对破壁HP-AX的提取能力依次为二氯甲烷>乙酸乙酯>丙酮>95%乙醇>异丙醇。徐煜等[45]比较了超声辅助提取HP-AX的效果，虾青素提取率大小为丙酮>二氯甲烷/甲醇(V二氧甲烷∶V甲醇=1∶3) >甲醇>氯仿。此外，研究[46]证明极性溶剂与非极性溶剂联合使用时的提取效果更佳，如以正己烷与乙醇混合液为提取溶剂、料液比(m料∶V提取剂)1∶640 (g/mL)、51 ℃下提取42 min可以使HP-AX提取率达92.04%。有机溶剂法相对简单、有效、后续分离技术成熟，但试剂用量大且丙酮等有毒试剂的使用仍存在极大隐患。

3.2.2 超分子溶剂超分子溶剂(SUPRAS)是两亲化合物(如羧酸、烷醇、烷基酚等)通过分子间有序的自组装过程形成的具有纳米结构的胶束聚集体[47-48]。SUPRAS存在离子—离子、离子—偶极、偶极—偶极、氢键、π—π和阳离子—π等多种分子间作用力，可为虾青素提供多种结合位点和萃取力[48-49]。因此，SUPRAS能有效透过细胞壁提取HP-AX， Salatti-Dorado等[34]用辛酸、盐酸和100%乙醇制成的SUPRAS获得了极高的虾青素提取率(96%)。SUPRAS具有合成简单、极性范围宽、可设计的特性，在HP-AX提取方面具有巨大潜力，但关于两性分子与虾青素间的主要作用力及作用机制有待进一步研究。

3.2.3 离子液体 ILs具有低熔点、高热稳定性、强溶解性和可设计性的特点，被广泛应用于虾壳甲壳素、黄连生物碱、牡丹黄酮等天然产物活性物质提取中[50-51]。ILs对HP-AX的提取效果不仅受阴、阳离子影响，还与其黏度、氢键接受能力(β值)及极性大小有关。Fan等[52]合成了一种成本比咪唑ILs低且生物相容性更好的质子ILs，即己酸乙醇铵(EAC)，在固液比1∶20 (g/g)、微波功率210 W下，其能有效溶解雨生红球藻壁的甘露聚糖并在50 s内一步提取虾青素，其提取效果比方婷等[53]用丙酮在50 ℃下水浴提取1 h的高约3.6倍。此外，与二乙醇己酸铵(DEAC)和三乙醇己酸铵(TEAC)相比，EAC因具有更高的氢键接受能力(β = 1.14)和更低的极性[ET(30) = 56.3]，对HP-AX的提取效果更为理想。离子液体的黏度大，常通过添加共溶剂来提高传质速率。Liu等[41]向纯ILs中添加水可以有效降低ILs黏度，提高HP-AX提取率。ILs既可以破壁又可以提取，还具有反应条件温和、操作简单、可循环的优点。但ILs具有低毒性且价格昂贵。

3.2.4 低共熔溶剂低共熔溶剂(DES)是由氢键供体与氢键受体组成的一种ILs类似物，其出现解决了ILs成本高和具有毒性的问题[54]。除了具有与离子液体相似的物理性质外，DES还具有低成本和高生物降解的特点，近年来备受关注[55]。Lee等[56]对比了65 W超声90 min条件下以丙酮为提取溶剂，DES(季鏻盐和1,2-丁二醇组成)或1-乙基-3-甲基咪唑溴([Emim][Br])为添加剂提取梭子蟹虾青素，发现以DES为添加剂的虾青素提取率是[Emim][Br]的1.5倍左右。Rodrigues等[55]证明了DES在60 ℃、2 h下对HP-AX的提取效率约是丙酮的5倍。DES提取法具有高效、简便、低毒或无毒、成本低的优点，在萃取领域已成为替代ILs的良好溶剂。但DES的黏度大，通过添加助剂降低黏度或者设计新的低黏度DES是推动DES广泛应用的前提。

3.3 超临界提取

超临界萃取技术是利用溶剂在超临界状态下对目标产物具有高溶解力而达到萃取的目的[57]。超临界萃取剂分为非极性溶剂(CO2、乙烯、乙烷等)和极性溶剂(甲醇、乙醇、丙酮等)[58]。其中，非极性CO2具有强溶解能力、化学惰性和低萃取温度，可以保护产物的活性和防止其降解[7, 59]。为了提高选择性和萃取效率，往往加入共溶剂提高CO2在超临界条件下对目标产物的溶解能力，如超临界CO2以极性乙醇为共溶剂，可以增强溶剂细胞渗透能力，未经破壁处理的HP-AX提取率也可达98%[60]。超临界萃取技术是一种清洁、绿色的技术，在虾青素的提取方面具有良好的应用前景。

3.4 双水相提取

双水相提取虾青素主要利用虾青素与互不相溶两相间的相互作用力差异达到高效分离萃取的目的，具有环境友好、能耗低、稳定性好的优势。Khoo等[61]用2-丙醇和硫酸铵构成双水相体系(ABS)提取HP-AX，其提取率为95.08%。ILs构建的ABS具有较高的稳定性和生物相容性，其中三丁基膦溴化铵([P4448]Br)和磷酸钾(K3PO4)ABS常温下对虾壳虾青素提取率达93.08%[62]。张莉莉等[35]利用[P4448]Br和K2HPO4/KH2PO4组成的pH可调节ABS直接提取HP-AX，在超声功率75 W、超声时间60 min 的条件下HP-AX提取率为96.09%。ABS表面性质、电荷作用和其他作用力不仅能有效溶解雨生红球藻壁的多糖，且[P4448]Br的氢原子与虾青素的羟基之间能形成强氢键作用。双水相体系从雨生红球藻中提取虾青素的优势还体现在虾青素溶解于IL富集相，其他亲水性分子溶解于盐富集相，利于虾青素的分离纯化。

3.5 酶解辅助提取

酶解法具有装置简单、适用范围广、重现性好的优点。张晔等[63]用纤维素酶和果胶酶组成的复合酶直接提取HP-AX，在pH 4.9、49 ℃下酶解6 h得到71.08%的HP-AX提取率，而Huang等[64]用碱性蛋白酶酶解1 h得到的HP-AX提取率为80%。Zhao等[32]用果胶酶辅助乙酸乙酯提取HP-AX获得75.30%的提取率。酶辅助提取避免了化学方法对虾青素活性的影响，但酶制剂比较昂贵，可以联用其他方法以降低成本。

3.6 物理辅助提取

目前，常用的物理辅助提取方法有超声辅助、高压辅助和磁场辅助。超声波产生的空化、乳化、扩散等效应能破坏雨生红球藻壁，提高溶剂的渗透性和传质能力，促进虾青素与溶剂的混合。Khoo等[61]研究表明，添加超声辅助双水相提取HP-AX，其提取率提高了16.70%。高压辅助利用压力使雨生红球藻细胞相互挤压、变形甚至破碎，加快提取速度和提高提取效率，如使用加压乙醇可在20 min内完成HP-AX的提取[29]。磁场辅助提取是一种通过在萃取液中添加磁性敏感添加剂以吸引目标生物分子的新分离技术[47]。这种磁性敏感剂可以通过改变材料的某些性质(扩散系数、渗透压、黏度、表面张力和溶解度)，影响相平衡组成，强化分离过程[65]。因此，磁场可以改变雨生红球藻壁溶解度、渗透压等，使溶剂直接渗透细胞壁提取虾青素，如与超声辅助相比，磁场辅助萃取雨生红球藻可获得最高的虾青素提取率(40.27%)[66]。

超声、高压等物理辅助可对雨生红球藻壁造成破坏，与酶辅助相比，物理辅助溶剂提取能节省提取时间，提高虾青素提取率且方法简便、成本低。此外，对于黏度大的提取溶剂，例如ILs、DES，采取超声辅助有利于提高传质效率，增大HP-AX提取率。

4 展望

近年来，破壁技术和提取技术取得了很大的进展，为雨生红球藻的有效利用和虾青素的高效提取提供了新的方法，如脉冲电场法、离子液体法、DES法、双水相法等破壁提取技术等，但这些研究还处于初步阶段，许多基础科学问题需进一步研究。未来的研究方向将会着力于：① 多种破壁方法结合使用，提高破壁率；② 探索更绿色高效的提取体系，深入研究其提取机理，为工业化生产提供切实可行的理论依据；③ 简化工艺，将破壁和提取同步进行；④ 提取溶剂的循环利用，有效降低提取成本。

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