生鲜畜禽肉中沙门氏菌全基因组分析与分子溯源

宋 晟1,2 高 晗1,2 严 礼1,2 郭焜鹏1,2 张海韵1,2 王芳斌1,2

(1. 食品安全监测与预警湖南省重点实验室,湖南 长沙 410117;2. 湖南省食品质量监督检验研究院,湖南 长沙 410117)

摘要:依据GB 4789.4—2016对从长沙市生鲜市场随机采集的生鲜猪肉、鸡肉进行检验。结果显示:有20份生鲜猪肉样品检出沙门氏菌,检出率为83.3%;有20份生鲜鸡肉样品检出沙门氏菌,检出率为74.1%;总检出率为78.4%。通过对其中40株沙门氏菌进行全基因组测序与分子溯源研究,结果表明:20株猪源性沙门氏菌与20株鸡源性沙门氏菌按分子溯源分析可分为5个明显不同的聚类,清晰反映了沙门氏菌的污染源分布及交叉污染情况,实现了精准溯源;其中发现了15个致病基因,从基因层面阐明了沙门氏菌可能存在的致病基因与致病机制,提示了沙门氏菌潜在的致病风险;试验发现了15个耐药基因,从基因层面阐明了沙门氏菌可能存在的耐药基因与耐药机制。

关键词:沙门氏菌;全基因组测序;系统进化树;分子溯源研究

沙门氏菌广泛分布于自然界,是一种属于肠杆菌科的革兰氏阴性杆菌,就邦戈尔沙门氏菌和肠道沙门氏菌这两个物种而言,迄今就已发现2 500余种血清型。作为一种人畜共患的主要病原菌,沙门氏菌通常会引起发热、呕吐等不良反应,是腹泻病全球四大病因之一[1-2]。某种情况下,沙门氏菌甚至可以进入血液,引发脑膜炎。为治疗沙门氏菌病,通常采用抗微生物药物,但大量抗生素的滥用,导致部分菌株产生耐药性,使药物失效[3-4]。人类患沙门氏菌病有可能是食用了被沙门氏菌污染的动物源性食品,如蛋、肉、禽和奶等。对于沙门氏菌以及其他食源性致病菌的溯源研究,主要有传统的沙门氏菌分离鉴定技术、多位点序列分型(Multi locus sequence typing,MLST)技术以及脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis,PFGE),近年来,随着新一代基因组测序技术的发展,基于全基因组测序分子分型技术广泛应用于食源性致病菌溯源中,具有快速精准等技术优势[5-7]

实验室对长沙市销售的生鲜鸡肉、生鲜猪肉进行了随机取样调查,依据GB 4789.4—2016分离、鉴定样品中的沙门氏菌,以充分了解长沙市销售的生鲜鸡肉、生鲜猪肉的污染状况,为防治沙门氏菌所引起的食源性疾病提供参考依据,并对分离鉴定出的40株沙门氏菌,进行全基因测序与分子溯源分析,研究其溯源关系、致病机理、耐药机理,为沙门氏菌基因层面的深入研究提供一定的试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

鼠伤寒沙门氏菌标准菌株ATCC14028:实验室保存;

生鲜猪肉(24份,每份2 kg)、生鲜鸡肉(27份,每份2 kg):湖南省长沙市各大农贸市场;

缓冲蛋白胨水(BPW)、四硫酸钠煌绿增菌液(TTB)、亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)、HE琼脂:青岛海博生物技术有限公司;

亚硫酸铋琼脂(BS)、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂(XLD)、革兰氏染色液试剂盒(Gram Stain)、三糖铁琼脂(TSI)、营养琼脂(NA):北京陆桥技术股份有限公司;

革兰氏阴性菌鉴定试剂卡(GN):法国Chromagar公司。

1.2 仪器

拍击式均质器:Masticator Silver型,西班牙IUL公司;

低温培养箱:MIR-254L-PC型,日本松下电器产业株式会社;

全自动微生物鉴定系统:VITEK 2 compact30型,法国生物梅里埃股份有限公司。

1.3 样品的采集与处理

将采集的新鲜猪肉24份与整鸡27份放入无菌均质袋中,用BPW冲淋后,拍击式均质器拍击猪肉2 min,用手搓揉整鸡2 min,BPW淋洗液培养18 h。

1.4 增菌与分离培养

吸取1 mL培养18 h的BPW淋洗液,转种至10 mL TTB中,(42±1) ℃培养24 h,同时吸取1 mL培养18 h的BPW淋洗液,转种至10 mL SC中,(36±1) ℃培养24 h。从TTB与SC中各挑1环划线至XLD、BS、HE平板。BS平板与XLD平板(36±1) ℃培养48 h,HE平板(36±1) ℃培养24 h。

1.5 生化试验

自选择性琼脂平板上挑取沙门氏菌典型菌落,接种三糖铁,(36±1) ℃培养24 h。

1.6 革兰氏染色

自选择性琼脂平板上挑取沙门氏菌典型菌落,经生理盐水稀释,涂片固定后,革兰氏染色,显微镜观察细菌形态。

1.7 鉴定与菌株保存

自选择性琼脂平板上挑取典型菌落,接种营养琼脂(36±1) ℃培养24 h,得到纯化单菌落,采用全自动微生物生化鉴定系统进行菌种鉴定。单菌落经营养琼脂纯化后用菌种保存管于-70 ℃保存。

1.8 全基因组测序

对40株沙门氏菌进行基因组DNA的提取、测序、功能基因预测注释等工作由广州研科生物科技有限公司完成。

2 结果与分析

2.1 菌株形态、生化鉴定结果

分离获得的40株典型菌株,在BS琼脂培养基上,形态为棕褐色或黑色且有金属光泽,菌落周围呈黑色;在HE琼脂培养基上,形态为蓝绿色,带黑色中心;在XLD琼脂培养基上,形态为粉红色,带黑色中心。接种三糖铁琼脂,斜面红色产碱,底层黄色产酸,产H2S琼脂呈黑色,产气,琼脂中有气泡;经革兰氏染色,油镜可观察,两端钝圆的红色杆菌,革兰氏阴性,经全自动微生物生化鉴定系统鉴定为沙门菌属。

24份生鲜猪肉中有20份样品检出沙门氏菌,检出率为83.3%;27份生鲜整鸡中有20份样品检出沙门氏菌,检出率为74.1%,说明零售生鲜猪肉与生鲜整鸡沙门氏菌的污染率非常高。

2.2 40株沙门氏菌基因组基本信息

采用二代测序技术对40株沙门氏菌进行全基因组测序,并进行序列组装。由表1可知,猪源性沙门氏菌的scaffold数目在24~71,基因组总长度分布为3 842 688~5 019 323 bp,GC含量平均为54.08%。由表2可知,基因数在4 012~4 382,基因平均长度在932~958 bp。鸡源性沙门氏菌的scaffold数目在23~73,基因组总长度分布为4 638 420~5 201 462 bp,GC含量平均为51.93%。基因数在4 016~4 476,基因平均长度在930~959 bp。20株猪源性沙门氏菌基因组总长度的平均值比20株鸡源性沙门氏菌基因组总长度的平均值小425 799 bp,而GC平均含量却比20株鸡源性沙门氏菌多2.15%,说明猪源性沙门氏菌与鸡源性沙门氏菌在基因组层面存在差异,也暗示两者来源不同,在运输与销售环节的交叉污染可能性小,而饲养、屠宰运输环节猪与猪之间、鸡与鸡之间污染可能性大。

2.3 猪源性、鸡源性沙门氏菌单拷贝直系同源基因分析

直系同源是指不同物种之间的某一部分序列具有同源性,例如蛋白质的同源性,DNA序列的同源性,而单拷贝直系同源基因是指在不同物种中具有相同序列,相同功能,但基因组中拷贝数为1的基因。单拷贝直系同源基因,大部分为管家基因,在分子系统学中起重要的分子标记作用,通常用于构建生命树的主干及主干和末梢之间的分枝[8]。分别对20株鸡源性沙门氏菌与20株猪源性沙门氏菌的基因组信息进行分析,统计基因家族、单拷贝直系同源基因、多拷贝直系同源基因、独立旁系同源基因、其他直系同源基因。由表3、4可知,20株猪源性沙门氏菌共有3 988个基因家族,单拷贝直系同源基因数在2 170~2 191,鸡源性沙门氏菌共有3 919个基因家族,单拷贝直系同源基因数在2 159~2 183。单拷贝直系同源基因主要包括内肽酶活性基因、水解酶基因、蛋白质分泌调节基因、核糖体结构基因、谷氨酰-tRNA还原酶基因等。

表1 20株猪源性沙门氏菌基因组信息

Table 1 20 strains of pig-derived Salmonella genome information

菌株组装片段数基因组长度GC含量/%基因数量基因平均长度/bpFC10701633 983 70954.114 210946FC10702623 964 02954.134 210942FC10717594 032 09953.964 291940FC10718684 084 75854.064 347940FC10726553 996 83454.114 223946FC10728243 842 68854.154 012958FC10730384 118 77254.094 382940FC10733413 947 78154.134 145952FC10738554 801 22754.124 163950FC10739434 012 23354.064 305932FC10743464 892 10054.034 197947FC10745425 019 32353.974 355932FC10755454 753 31254.104 060951FC10758564 940 49054.074 272940FC11958294 727 32254.144 112945FC11961404 835 69854.084 107945FC11967484 847 34454.064 219937FC11980374 836 24154.104 119952FC11983414 839 30154.114 117953FC12045714 944 62554.094 239947平均值484 470 99454.084 204945

2.4 基于单拷贝直系同源基因分别构建猪源性、鸡源性沙门氏菌系统进化树

基于单拷贝直系同源基因分别构建猪源性沙门氏菌系统进化树(见图1),结果显示20株猪源性沙门氏菌明显聚集为5簇,FC10728、FC11983、FC10743、FC11961、FC11980 5株聚集为1簇,FC10733、FC12045、FC10701、FC10726 4株聚集为1簇,FC10738、FC10718、FC10717 3株聚集为1簇,FC10758、FC11967 2株聚集为1簇,FC10739、FC10745 2株聚集为1簇,另有4株FC10755、FC11958、FC10730、FC10702无明显聚集。

FC10728、FC11983、FC10743、FC11961、FC11980 5株猪源性沙门氏菌聚集为1簇,但采样点各不相同,说明该菌种在不同销售点均存在污染,而污染源可能是来源于同一个屠宰基地或同一个养殖生产基地。FC10733与FC10701聚集为1簇,且来源于同一销售点,说明销售点存在交叉污染,或来源于同一供货渠道。另有FC10707与FC10743,FC11983与FC119582分别来源于2个销售点,且并不聚集,说明该销售点所销售的猪肉存在多株猪源性沙门氏菌污染的情况,可能是不同的供货渠道所致。从同源性的程度来看,FC10701、FC10726与FC10733同源性极高,分别来源于2个销售点,FC10717与FC10738同源性极高,分别来源于2个销售点,FC10728与FC10743同源性极高,分别来源于2个销售点,FC11961、FC11980与FC11983同源性极高,分别来源于3个销售点,说明其销售的猪肉分别来源于同一供货渠道。

表2 20株鸡源性沙门氏菌基因组信息

Table 2 20 strains of chicken-derived Salmonella genome information

菌株组装片段数基因组长度GC含量/%基因数量平均基因长度/bpFC10706475 045 96451.734 352938FC10707494 949 33951.814 260941FC10712374 776 28252.084 100952FC10721464 736 76651.954 038954FC10727234 638 42052.224 016959FC10729634 818 27252.184 157942FC10731475 040 31951.724 345937FC10735515 029 49851.914 332939FC10736585 054 92251.734 352939FC10754434 940 69651.964 259939FC11951564 680 34152.164 046948FC11959435 154 12451.664 394934FC11960524 865 77052.014 171945FC11964494 841 87251.934 138947FC11978735 201 46251.624 476930FC11981604 878 76252.124 194947FC11982504 791 96852.014 140943FC11987454 782 89551.974 094948FC11988564 923 30151.934 256935FC12043464 784 89851.974 099947平均值504 896 79451.934 211943

表3 20株猪源性沙门氏菌直系基因与旁系基因分析

Table 3 Analysis of orthologous gene and paralogous gene of 20 strains of pig-derived Salmonella

菌株单拷贝直系同源基因多拷贝直系同源基因旁系同源基因其他直系同源基因未聚类基因FC107012 1761 53804897FC107022 1831 520047235FC107172 1701 55905557FC107182 1741 554454174FC107262 1731 54305016FC107282 1901 50203191FC107302 1711 543057890FC107332 1801 52804352FC107382 1721 55104364FC107392 1751 552254432FC107432 1811 53304776FC107452 1721 5530521109FC107552 1911 475233161FC107582 1871 512055419FC119582 1851 507639123FC119612 1891 50504085FC119672 1901 500049336FC119802 1891 50404251FC119832 1881 50804192FC120452 1761 541050913

基于单拷贝直系同源基因分别构建鸡源性沙门氏菌系统进化树(见图2),结果显示20株鸡源性沙门氏菌明显聚集为5簇,FC10706、FC10707、FC10731、FC10736、FC11978、FC11982 6株聚集为1簇,FC10721、FC11960、FC11964、FC11987、FC12043 5株聚集为1簇,FC10754、FC11959、FC11988 3株聚集为1簇,FC10729、FC11981 2株聚集为1簇,另有4株FC10712、FC10727、FC10735、FC11951无明显聚集。

FC10706、FC10707、FC10731、FC10736、FC11978、FC11982 6株鸡源性沙门氏菌聚集为1簇,其中FC10706、FC10707与FC10731来源于同一品牌超市的2个分店且同源性极高,说明同一品牌超市的供货渠道可能存在污染,导致分店销售的鸡肉污染同一沙门氏菌。FC11982与FC11959、FC11988与FC11960分别聚集成不同簇,但来源于同一销售点,说明该销售点所销售的鸡肉存在多株鸡源性沙门氏菌污染的情况,可能是不同的供货渠道所致,且存在交叉污染的可能。从同源性的程度来看,FC11960、FC12043、FC11987与FC11964同源性极高,分别来源于4个销售点,FC10754与FC11959同源性极高,分别来源于2个销售点,FC10728与FC10743同源性极高,分别来源于2个销售点,FC10706、FC10707、FC10731、FC10736与FC11978同源性极高,分别来源于4个销售点,说明其销售的鸡肉分别来源于同一供货渠道。

表4 20株鸡源性沙门氏菌直系基因与旁系基因分析

Table 4 Analysis of orthologous gene and paralogous gene of 20 strains of chicken-derived Salmonella

菌株单拷贝直系同源基因多拷贝直系同源基因旁系同源基因其他直系同源基因未聚类基因FC107062 1691 52806541FC107072 1721 52205660FC107122 1731 515237733FC107212 1821 46903870FC107272 1801 504030032FC107292 1731 52824513FC107312 1711 52406464FC107352 1631 546454574FC107362 1701 52606551FC107542 1671 551252514FC119512 1761 496032054FC119592 1591 567263234FC119602 1741 492048916FC119642 1741 492046111FC119782 1601 551368775FC119812 1651 544047114FC119822 1831 49504548FC119872 1771 48204323FC119882 1691 537046783FC120432 1771 48304381

图1 基于单拷贝直系同源基因构建20株猪源性沙门氏菌系统进化树

Figure 1 Phylogenetic tree of 20 pig-derived Salmonella strain based on single-copy orthologous genes

图2 基于单拷贝直系同源基因构建20株鸡源性沙门氏菌系统进化树

Figure 2 Phylogenetic tree of 20 chicken-derived Salmonella strain based on single-copy orthologous genes

2.5 猪源性、鸡源性沙门氏菌致病基因分析

通过数据比对与分析,发现20株猪源性沙门氏菌,20株鸡源性沙门氏菌,共涉及15种致病基因,如表5和表6所示。整体比较而言,鸡源性沙门氏菌致病基因较猪源性沙门氏菌多,20株鸡源性沙门氏菌共有277个致病基因,而20株猪源性沙门氏菌共有271个致病基因。fimAfimDipaH9.8ipgD & sopBK08303ptrBsipA & ipaAsipB & ipaB & bipBsipC & ipaC & bipCsipD & ipaD & bipDyeeJ 11个基因为20株猪源性沙门氏菌所共有;fimAfimDipaH9.8ipgD & sopBK08303ptrBsipA & ipaAsipB & ipaB & bipBsipC & ipaC & bipCsipD & ipaD & bipDsptPyeeJ 12个基因为20株鸡源性沙门氏菌所共有。关于sopE基因,猪源性沙门氏菌中只有FC10730拥有,但鸡源性沙门氏菌中有FC10706、FC10707、FC10712、FC10731、FC10736、FC11978 6株拥有该基因。

15种致病基因涉及多种致病机理。fimA,基因注释为菌毛蛋白,特异性介导细菌对于骨髓源树突状细胞的粘附和侵袭作用[9]fimD,基因注释为外膜引入蛋白,位于菌毛顶端的蛋白,是所有血清型的共有蛋白,介导沙门氏菌直接粘附宿主细胞。yeeJ,基因注释为黏附素,介导沙门氏菌对宿主细胞的粘附,对沙门氏菌的定植起重要作用,化学性质方面,黏附素可能为沙门氏菌表面某种特定的蛋白质结构或糖脂成分[10]sipA & ipaAsipB & ipaB & bipBsipC & ipaC & bipCsipD & ipaD & bipD,基因注释分别为侵袭素A、侵袭素B、侵袭素C、侵袭素D,4个基因均位于致病岛SPI-1,细菌进入宿主上皮细胞的关键因子,是沙门氏菌的关键毒力因子。ipaH9.8,基因注释为侵袭质粒抗原,可抑制血小板的正常凝集,促使水肿[11-12]sopB,基因注释为磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸4-磷酸酶,是一种肌醇磷酸酶,在发病机理中起重要作用,当沙门氏菌侵入人肠道上皮细胞并分泌sopB蛋白后,将激发3-磷酸肌醇激酶依赖性的信号传导,从而使肠上皮细胞Cl-水平提高,打乱宿主的多种信号传导途径。K08303,基因注释为蛋白酶,在上皮细胞起信号传导作用。ptrB,基因注释为寡肽酶B[13-14]。另有4个致病基因为个别沙门氏菌所有,其中sopE,只有7株沙门氏菌具有,该基因注释为效应蛋白,可介导肌动蛋白集合,起细菌内化作用;能刺激肠道上皮细胞导致炎症和腹泻,促进炎症细胞的趋化和增殖;破坏宿主细胞的肌动蛋白,进而使得细菌侵入;引起迟发性细胞毒作用,引起黏膜炎症反应。sopD,基因注释为效应蛋白,在入侵真核细胞中起协同作用。sptP,基因注释为效应蛋白,能引起至少两种蛋白的去磷酸化,抑制肥大细胞的脱颗粒,导致抑制嗜中性粒细胞的聚集,阻止血管内容物流如感染部位,从而引起细菌的全身性感染[15]TROVE2 & SSA2,基因注释为SS-A / Ro核糖核蛋白,是一种RNA-蛋白质复合体,功能上属于一种红斑狼疮抗原,SS-A / Ro抗体可作为新生儿红斑狼疮(NLE)的血清学标志[16]

2.6 猪源性、鸡源性沙门氏菌耐药基因分析

通过数据比对与分析,发现20株猪源性沙门氏菌,20鸡源性沙门氏菌,共涉及15种耐药基因,如表7和表8所示。整体比较而言,鸡源性沙门氏菌与猪源性沙门氏菌的耐药基因分布情况基本类似,20株猪源性沙门氏菌共有294个耐药基因,20株鸡源性沙门氏菌共有293个耐药基因。acrAampGampC & penPnorRnorVnorWnsrRompCompFtolCYHB1 & hmplepApagPSIG2 & rpoS 14个耐药基因为20株猪源性沙门氏菌所共有;acrAampGampC & penPnorRnorVnorWnsrRompCompFtolCYHB1 & hmplepApagPSIG2 & rpoS 14个耐药基因为20株鸡源性沙门氏菌所共有,关于vanX基因,分别有14株猪源性沙门氏菌与13株鸡源性沙门氏菌有该基因。

15种耐药基因涉及多种耐药机制。acrA,基因注释为膜融合蛋白;TolC,基因注释为外膜通道蛋白,两者相互配合,形成主动外排系统,由膜融合蛋白acrA捕获抗菌药物后,通过外膜通道蛋白TolC,将抗菌药物运转至外界。ompCompF,基因注释为外膜孔蛋白,细菌接触抗菌药物后,发生外膜孔蛋白ompC、ompF的表达基因失活,造成孔蛋白丢失或严重减少,最终导致β-内酰胺类药物进入菌体内减少,切断β-内酰胺类药物输入细菌体内的途径,以产生耐药性。ampC & penP,基因注释为β-内酰胺酶,可使使易感抗生素水解而灭活[17]ampG,基因注释为β-内酰胺酶感应信号传感器,编码一种依赖质子动力势能的单要素渗透酶,起到向胞浆内传递诱导信号的作用。AmpG蛋白是细胞黏肽循环中的关键蛋白。若ampG基因缺失,细菌会完全丧失AmpC β-内酰胺酶的诱导性或只表达低水平诱导[18]YHB1 & hmpnorRnorVnorWnsrR,基因注释分别为一氧化氮双加氧酶、厌氧型一氧化氮还原酶转录调节因子、厌氧型一氧化氮还原酶、一氧化氮还原酶FoRd-AND(+)、Rrf2家族转录调节因子 & 一氧化氮敏感的转录阻遏物,沙门氏菌通过还原一氧化氮,实现对一氧化氮的脱毒,导致吞噬细胞无法杀死沙门氏菌,从而提高沙门氏菌对宿主的抗性[19]PagP,基因注释为酰基转移酶,沙门氏菌细胞外膜的酰基转移酶PagP,能将磷脂的C16碳脂肪酸链转移到内毒素分子的脂肪酸链上,形成次级脂肪酸链,PagP产生的内毒素可以干扰TLR4的识别,使沙门氏菌对阳离子抗菌肽产生抗性[20]。SIG2 & rpoS是RNA聚合酶的主要识别因子,当沙门氏菌处于逆境条件下sigma因子启动调控网,改变其对不同环境压力的应答,以克服胁迫环境。lepA,基因注释为GTP结合蛋白,能识别错误转位的核糖体,使其有机会正确转位。另有vanX为27株沙门氏菌具有,该基因注释为D-丙氨酰-D-丙氨酸二肽酶,可将细胞胞壁中合成的D-丙氨酰-D-丙氨酸水解,导致细胞壁前质末端的二肽发生结构化变化,从而降低万古霉素药物分子跟细菌细胞壁前质的结合力,以获得对万古霉素的耐药性[21]

表5 20株猪源性沙门氏菌致病基因分析

Table 5 Analysis of pathogenic genes of 20 strains of pig-derived Salmonella

菌株fimAfimDipaH9.8ipgD &sopBK08303ptrBsipA & ipaAsipB & ipaB & bipBsipC & ipaC& bipCsipD & ipaD & bipDyeeJsptPTROVE2 & SSA2sopDsopE总计FC10730●●●●●●●●●●●●●●●15FC10702●●●●●●●●●●●●●●14FC10728●●●●●●●●●●●●●●14FC10739●●●●●●●●●●●●●●14FC10743●●●●●●●●●●●●●●14FC10745●●●●●●●●●●●●●●14FC10758●●●●●●●●●●●●●●14FC11961●●●●●●●●●●●●●●14FC11967●●●●●●●●●●●●●●14FC11980●●●●●●●●●●●●●●14FC11983●●●●●●●●●●●●●●14FC10717●●●●●●●●●●●●●13FC10718●●●●●●●●●●●●●13FC10726●●●●●●●●●●●●●13FC10733●●●●●●●●●●●●●13FC10738●●●●●●●●●●●●●13FC10755●●●●●●●●●●●●●13FC11958●●●●●●●●●●●●●13FC12045●●●●●●●●●●●●●13FC10701●●●●●●●●●●●●12总计20202020202020202020201918131271

† ●表示携带该基因。

表6 20株鸡源性沙门氏菌致病基因分析

Table 6 Analysis of pathogenic genes of 20 strains of chicken-derived Salmonella

菌株fimAfimDipaH9.8ipgD &sopBK08303ptrBsipA &ipaAsipB & ipaB& bipBsipC & ipaC& bipCsipD & ipaD& bipDyeeJsptPTROVE2 &SSA2sopDsopE总计FC10706●●●●●●●●●●●●●●●15FC10707●●●●●●●●●●●●●●●15FC10712●●●●●●●●●●●●●●●15FC10731●●●●●●●●●●●●●●●15FC10736●●●●●●●●●●●●●●●15FC11978●●●●●●●●●●●●●●●15FC10727●●●●●●●●●●●●●●14FC10735●●●●●●●●●●●●●●14FC10754●●●●●●●●●●●●●●14FC11959●●●●●●●●●●●●●●14FC11988●●●●●●●●●●●●●●14FC10721●●●●●●●●●●●●●13FC10729●●●●●●●●●●●●●13FC11951●●●●●●●●●●●●●13FC11960●●●●●●●●●●●●●13FC11964●●●●●●●●●●●●●13FC11981●●●●●●●●●●●●●13FC11982●●●●●●●●●●●●●13FC11987●●●●●●●●●●●●●13FC12043●●●●●●●●●●●●●13总计20202020202020202020202014176277

† ●表示携带该基因。

表7 20株猪源性沙门氏菌耐药基因分析

Table 7 Analysis of resistance genes of 20 strains of pig-derived Salmonella

菌株acrAampGampC &penPompCompFtolCnorRnorVnorWnsrRYHB1 &hmplepApagPSIG2 &rpoSvanX总计FC10701●●●●●●●●●●●●●●●15FC10726●●●●●●●●●●●●●●●15FC10728●●●●●●●●●●●●●●●15FC10730●●●●●●●●●●●●●●●15FC10733●●●●●●●●●●●●●●●15FC10739●●●●●●●●●●●●●●●15FC10743●●●●●●●●●●●●●●●15FC10745●●●●●●●●●●●●●●●15FC10758●●●●●●●●●●●●●●●15FC11961●●●●●●●●●●●●●●●15FC11967●●●●●●●●●●●●●●●15FC11980●●●●●●●●●●●●●●●15FC11983●●●●●●●●●●●●●●●15FC12045●●●●●●●●●●●●●●●15FC10702●●●●●●●●●●●●●●14FC10717●●●●●●●●●●●●●●14FC10718●●●●●●●●●●●●●●14FC10738●●●●●●●●●●●●●●14FC10755●●●●●●●●●●●●●●14FC11958●●●●●●●●●●●●●●14总计202020202020202020202020202014294

† ●表示携带该基因。

表8 20株鸡源性沙门氏菌耐药基因分析

Table 8 Analysis of resistance genes of 20 strains of chicken-derived Salmonella

菌株acrAampGampC &penPompCompFtolCnorRnorVnorWnsrRYHB1 &hmplepApagPSIG2 &rpoSvanX总计FC10706●●●●●●●●●●●●●●●15FC10707●●●●●●●●●●●●●●●15FC10712●●●●●●●●●●●●●●●15FC10727●●●●●●●●●●●●●●●15FC10729●●●●●●●●●●●●●●●15FC10731●●●●●●●●●●●●●●●15FC10736●●●●●●●●●●●●●●●15FC10754●●●●●●●●●●●●●●●15FC11959●●●●●●●●●●●●●●●15FC11978●●●●●●●●●●●●●●●15FC11981●●●●●●●●●●●●●●●15FC11982●●●●●●●●●●●●●●●15FC11988●●●●●●●●●●●●●●●15FC10721●●●●●●●●●●●●●●14FC10735●●●●●●●●●●●●●●14FC11951●●●●●●●●●●●●●●14FC11960●●●●●●●●●●●●●●14FC11964●●●●●●●●●●●●●●14FC11987●●●●●●●●●●●●●●14FC12043●●●●●●●●●●●●●●14总计202020202020202020202020202013293

† ●表示携带该基因。

3 结论

(1) 长沙市零售的生鲜猪肉与生鲜整鸡,沙门氏菌的污染率非常高,如缺乏必要的微生物学知识及防护措施知识,很容易引发交叉污染,发生沙门氏菌食物中毒事件,因此在日常的食品安全监管以及卫生督导工作中,应加强沙门氏菌来源、防护、预防治疗的教育工作,消费者也应增强卫生防范意识。

(2) 通过对40株沙门氏菌进行全基因组测序,统计基因家族、单拷贝直系同源基因、多拷贝直系同源基因、独立旁系同源基因、其他直系同源基因相关信息,并以猪源性沙门氏菌2 170~2 191个单拷贝直系同源基因,鸡源性沙门氏菌2 159~2 183个单拷贝直系同源基因,构建系统进化树,实现了猪源性、鸡源性沙门氏菌的全基因溯源。

(3) 通过对猪源性、鸡源性沙门氏菌致病基因的预测可知,生鲜畜禽肉中筛选出的沙门氏菌含有多种毒力因子,包括侵袭基因、分泌效应蛋白、黏附素、肌醇磷酸酶、菌毛蛋白、外膜引入蛋白、效应分子,通过协同作用,产生综合毒力。在基因层面上阐明了沙门氏菌可能存在的致病基因与致病机制,提示了沙门氏菌潜在的致病风险,为药物研发与疾病治疗提供了分子基础。多个耐药基因,多种耐药机制的发现,说明养殖环节可能存在抗生素滥用的情况,加快高耐药性毒株的产生,因此,农业生产监管部门应加大抗生素使用危害的宣传力度,加强对养殖户抗生素使用的监管力度,从源头减少抗生素的使用,降低对抗生素的依赖。

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Whole genome analysis and molecular traceability study of Salmonella in fresh livestock and poultry meat

SONG Sheng1,2 GAO Han1,2 YAN Li1,2 GUO Kun-peng1,2 ZHANG Hai-yun1,2 WANG Fang-bin1,2

(1. Hunan Provincial Key Laboratory of Food Safety Monitoring and Early Warning, Changsha, Hunan 410117, China; 2. Hunan Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research, Changsha, Hunan 410117, China)

Abstract In order to investigate the contamination status of Salmonella in fresh pork and fresh chicken, and research its whole genome characteristics and molecular traceability, the laboratory randomly collected 24 fresh pork and 27 fresh chicken from the fresh market in Changsha, were inspected according to “National Food Safety Standard Food microbiological examination: Salmonella” GB 4789.4—2016. The results showed that in 24 randomly selected fresh pork, 20 samples were detected, with the detection rate of 83.3%; in 27 randomly selected fresh chicken, 20 samples were detected, and the detected rate is 74.1%; the total detection rate was 78.4%. The results showed that the fresh pork and fresh chicken sold on the fresh market in Changsha were seriously contaminated by Salmonella, which had great risk for food safety. 40 of them were analyzed by whole genome sequencing and molecular traceability analysis. The results showed that 20 kinds of pig-derived Salmonella strains and 20 kinds of chicken-derived Salmonella strains could be divided into 5 clusters, and clearly reflected the distribution of pollution sources and cross-contamination of Salmonella, achieving precise traceability. 15 pathogenic genes were found, which clarified the possible pathogenic genes and pathogenic mechanisms on the genetic level, and suggested the potential risk of Salmonella. The research on the pathogenic mechanism of related diseases provided guidance for diseases control. 15 genes involved in drug-resistance were found, which clarified the possible drug-resistant genes and the relative mechanisms on the genetic level, providing important data for the control of highly drug-resistant strains.

Keywords Salmonella; whole-genome sequencing; phylogenetic tree; molecular traceability study

基金项目:湖南省市场监督管理局科技计划项目(编号:2019KJJH52);湖南省科技创新平台与人才计划项目(编号:2019TP1058)

作者简介:宋晟,男,湖南省食品质量监督检验研究院工程师,硕士。

通信作者:高晗(1982—),男,湖南省食品质量监督检验研究院工程师,硕士。E-mail:125069250@qq.com

收稿日期:2020-08-01

DOI10.13652/j.issn.1003-5788.2020.09.009