木聚糖—铁复合物的制备工艺优化及抗氧化活性研究

李 霞1LI Xia1 孙鹤飞1SUN He-fei1 陶扬妃1TAO Yang-fei1 陈 清1CHEN Qing1 周玉恒2ZHOU Yu-heng2 单 杨3SHAN Yang3 关 媛1GUAN Yuan1

(1.桂林理工大学化学与生物工程学院,广西 桂林 541006;2.广西植物研究所,广西 桂林 541006; 3.湖南省农科院农产品加工研究所,湖南 长沙 410125)

摘要:以木聚糖(Xyl)与三氯化铁为底物,考察Xyl与柠檬酸钠质量比、制备温度及pH对产物得率的影响,通过响应面法优化以确定木聚糖—铁复合物(XPC)的制备工艺,采用红外光谱及X-射线衍射对Xyl和XPC结构进行表征和分析,并对XPC的DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基清除能力及还原能力进行研究。结果表明:制备XPC的最佳工艺条件为Xyl与柠檬酸钠质量比3∶1,制备温度70 ℃,pH 8.0,该条件下的得率为66.59%,含铁量为22.57%。红外光谱及X-射线衍射分析表明,铁(Ⅲ)离子成功与Xyl螯合且未破坏其基本骨架。XPC对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的最大清除率分别为73.44%,30.95%,22.72%。与Xyl相比,XPC抗氧化性能显著提高。

关键词:木聚糖;铁复合物;结构特征;抗氧化活性

木聚糖(Xyl)是自然界中含量丰富的多糖,具有甜度低、热量少、可发酵、润肠通便等特性;对双歧杆菌有显著增殖作用,可促进机体对钙和铁的吸收[1]。Xyl常作为促进人体钙、铁吸收,增强人体免疫等的功能性保健品[2]。此外,Xyl主链木糖重复单元上的糖基侧链的多变性及羟基的存在为其化学修饰提供了可能[3]。铁是人体中最重要的微量矿物质之一,对有机体的正常功能,尤其是作为新陈代谢和免疫功能的辅助因子的活性至关重要[4]。人体内缺乏铁时会出现乏力、免疫力下降及贫血等症状[5],而缺铁性贫血已成为一种世界上常见的营养性疾病。目前,补铁剂主要有无机和有机两种形式,无机铁会导致肠胃不适及口腔异味等[6-7],因此多糖铁复合物作为一种有机铁补充剂已成为研究热点。

多糖铁复合物具有较理想的稳定性和水溶性,具有免疫保护作用等优点,生物利用度高于无机补铁剂[8]。肖雄等[9]研究发现土党参多糖铁配合物在pH 3~12时可溶且能稳定存在;张喜峰等[10]研究表明螺旋藻多糖铁配合物具有较高免疫作用与较好的生物活性;Tang等[4]研究发现茶多糖铁配合物具有增加铁的吸收和生物利用度的能力。此外,多糖铁复合物具有良好的临床效果,且鲜有不良反应,可作为优良的补铁剂治疗缺铁性贫血症[11]。但关于Xyl修饰成多糖铁复合物及生物活性方面的研究鲜有报道。

试验拟以Xyl和FeCl3为底物,采用响应面分析法优化木聚糖—铁复合物(XPC)的制备工艺,通过红外光谱及X-射线衍射对Xyl和XPC结构进行表征和分析,并对Xyl和XPC的抗氧化活性进行研究,以期为治疗缺铁性贫血及Xyl的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Xyl:广西植物研究所;

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH):生物试剂,东京化成工业株式会社;

氯化铁、抗坏血酸、氢氧化钠等:国产分析纯;

傅里叶红外光谱仪:IS10型,美国Thermo Fisher公司;

X-射线衍射仪:Xpert3 Power型,荷兰帕纳公司;

紫外—可见分光光度计:UV760CRT型,上海傲谱分析仪器有限公司;

冷冻干燥机:FD-1B-50型,北京博医康实验仪器有限公司;

离心机:DL-5-B型,上海安亭科学仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 XPC的制备 称取60 mg Xyl及20 mg柠檬酸钠,用30 mL蒸馏水溶解,70 ℃水浴并不断搅拌。先逐滴加入20% NaOH溶液调节反应体系pH为8.0,之后缓慢滴加2.0 mol/L FeCl3溶液并搅拌,重复上述过程,保持反应体系pH为8.0。当反应体系中出现红棕色不溶沉淀时,停止滴加。70 ℃水浴1 h,4 000 r/min离心15 min,收集上层深红棕色离心液,流水透析24 h,浓缩冷冻干燥,得XPC。

1.2.2 单因素试验

(1)Xyl与柠檬酸钠质量比:制备温度70 ℃,pH 8.0,考察Xyl与柠檬酸钠质量比(1∶1,2∶1,3∶1,4∶1,5∶1)对XPC得率的影响。

(2)制备温度:Xyl与柠檬酸钠质量比3∶1,pH 8.0,考察制备温度(60,70,80,90,100 ℃)对XPC得率的影响。

(3)pH:Xyl与柠檬酸钠质量比3∶1,制备温度70 ℃,考察pH(7.0,7.5,8.0,8.5,9.0)对XPC得率的影响。

1.2.3 响应面试验设计 基于单因素试验,以Xyl与柠檬酸钠质量比、制备温度、pH为自变量[12],XPC得率为响应量,设计三因素三水平的优化试验[13]

1.2.4 XPC得率的测定 按照邻菲罗啉法[14]测定吸光度值,根据标准曲线(y=0.204 9x+0.003 1,R2=0.999 9,其中y为吸光度值,x为Fe2+浓度)计算铁的含量,并按式(1)、(2)分别计算XPC中含铁量及XPC得率。

(1)

式中:

S——XPC中含铁量,%;

C——Fe2+的质量浓度,mg/mL;

0.08——XPC的浓度,mg/mL。

(2)

式中:

Y——XPC得率,%;

C0——螯合前溶液中铁质量浓度,mg/mL;

C1——为螯合后溶液中铁质量浓度,mg/mL。

1.2.5 XPC的结构特征

(1)红外光谱分析:根据文献[15]。

(2)X射线衍射分析:根据文献[16]略作修改,采用X'Pert3 Powder型多功能X-射线衍射仪(Cu靶,λ=1.540 56 Å)分析Xyl和XPC的晶体结构,测试扫描步长为0.026 26°,扫描范围5°~ 90°,扫描速度0.656 5°/s。

1.2.6 XPC的抗氧化活性测定

(1)DPPH自由基清除能力:参考文献[17]的方法并略有改动,量取不同浓度的样品液2.0 mL,加入0.04 mg/mL DPPH溶液2.0 mL(乙醇作为溶剂),室温下混匀后避光反应30 min,517 nm处测定吸光值。按式(3)计算DPPH自由基清除率。

(3)

式中:

K——DPPH自由基清除率,%;

Ai——2.0 mL样品液和2.0 mL DPPH乙醇溶液的吸光度;

Aj——2.0 mL乙醇和2.0 mL样品液的混合液的吸光度;

Ac——2.0 mL乙醇和2.0 mL DPPH溶液混合液的吸光度。

(2)超氧阴离子清除能力:根据文献[18]。

(3)羟基自由基清除率能力:参考文献[19]的方法并略作改动,取9.0 mmol/L FeSO4和9.0 mmol/L水杨酸—乙醇溶液各1.0 mL,加入不同浓度的样品溶液1.0 mL,混均后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1.0 mL启动反应,37 ℃水浴30 min,于510 nm处测定吸光度,每组测3次,取平均值。在其他条件不变下改动3种试剂进行相应试验:蒸馏水代替多糖做空白对照,蒸馏水替换H2O2溶液测定多糖本底液吸光度,以抗坏血酸替换XPC为阳性对照。按式(4)计算羟基自由基清除率。

(4)

式中:

E——羟基自由基清除率,%;

A0——空白对照液的吸光度;

Ax——样品液的吸光度;

Ax0——多糖本底溶液的吸光度。

(4)还原性能力:参考杨柳等[20]的方法并略作修改,量取0.5 mL不同浓度的样品液于试管,依次加入0.5 mL的1% K3Fe(CN)6溶液与0.5 mL的PBS溶液(0.2 mol/L,pH 6.7),50 ℃水浴20 min,冷却,依次加入0.5 mL的10% TCA溶液,0.5 mL的0.1% FeCl3溶液及2.0 mL蒸馏水,混匀后静置10 min,于700 nm处测定其吸光度值,以抗坏血酸为阳性对照。

1.3 数据分析

采用Excel软件和Design-Expert 8.0.6软件中的多元线性回归分析程序对验结果进行处理,所有数据均为3次重复试验的平均值。采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析,P<0.05差异显著,P<0.01差异极显著。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

由图1可知,当Xyl与柠檬酸钠质量比为3∶1时,产物得率最高(62.9%);螯合的最适温度为70 ℃,温度过低不利于Xyl与铁离子的螯合,温度过高可能会破坏Xyl的自身结构;当pH为8.0时,XPC得率最大,说明pH的增大有利于Xyl的溶解和扩散,但pH过高会使OH-与Xyl分子的活性基团竞争,与Fe3+结合形成沉淀,导致Fe3+不能与Xyl螯合[21]

图1 单因素对XPC得率的影响

Figure 1 Effects of single factor on the yield of XPC

2.2 制备工艺优化

2.2.1 响应面试验分析 综合单因素试验结果,以Xyl与柠檬酸钠质量比、制备温度和pH为影响因素,以XPC得率为响应值,根据Box-Behnken试验设计原理进行试验设计,因素与水平表见表1,试验设计及结果见表2。

如表2可知,XPC得率为46.44%~65.91%,对试验数据进行二次多项式回归拟合,得回归方程:

Y=59.68+3.50A+5.95B+3.25C+2.70AB-1.60AC-1.30BC-2.54A2-3.69B2+0.31C2

(6)

2.2.2 响应面回归模型分析 由表3可知,模型P<0.01,说明回归模型具有高度显著性;失拟项P=0.238 1>0.05,说明失拟项不显著;模型R2=0.983 3,表明可用该模型解释98.33%的关于各因素与得率之间的关系变化;RAdj2=0.961 7,表明回归方程的拟合程度较好,试验误差较小,可信度较高[22],能很好地对XPC得率进行分析和预测。回归模型中一次项A、B、C及交互项AC影响极显著(P<0.01),二次项(A2、B2)具有高度显著性(P<0.01);各因素对XPC的影响大小依次为pH>制备温度>Xyl与柠檬酸钠质量比。

由图2可知,制备温度对XPC得率的影响最大,其次是Xyl与柠檬酸钠质量比和pH;Xyl与柠檬酸钠质量比和制备温度的等高线为椭圆形,说明这两个因素交互作用显著,而Xyl与柠檬酸钠质量比和pH的等高线以及制备温度和pH的等高线皆为圆形,说明Xyl与柠檬酸钠质量比和pH、制备温度和pH间的交互作用不明显,与方差分析结果一致。

表1 因素与水平表

Table 1 Factors and levels of response surface analysis

因素AXyl与柠檬酸钠质量比B制备温度/℃CpH-12︰1657.503︰1708.014︰1758.5

表2 响应面试验设计及结果

Table 2 Experiments design and results of response surface analysis

试验号ABCY多糖得率/%11-1048.53200060.91301163.344-10-148.525-10159.9160-1-146.71700058.83810163.2190-1154.131000058.7111-10053.031211065.911300060.511410-158.221501-161.131600059.5117-1-1046.44

表3 回归模型方差分析

Table 3 Regression model variance analysis results

来源平方和自由度均方和F值P值显著性模型600.98966.7545.69<0.0001∗∗A98.00198.0067.07<0.0001∗∗B283.221283.22193.83<0.0001∗∗C84.50184.5057.830.0001∗∗AB29.16129.1619.960.0029∗∗AC10.24110.247.010.0331∗BC6.7616.764.630.0685∗A227.16127.1618.590.0035∗∗B257.33157.3339.240.0004∗∗C20.4010.400.280.6150残差10.2371.46 失拟项6.3032.102.140.2381不显著误差3.9340.98总和611.0116

† *表示差异显著(P<0.05);**表示差异极显著(P<0.01);R2=0.983 3;RAdj2=0.961 7。

2.2.3 模型验证实验 利用Design-Expert 8.0.6软件分析,得到最佳制备条件为Xyl与柠檬酸钠质量比为3.2∶1、制备温度70 ℃、pH 8.09,此条件下XPC得率为66.59%。为验证模型的可靠性与方便实际操作,将工艺参数修正为Xyl与柠檬酸钠质量比3∶1、制备温度70 ℃、pH 8.0,此条件下制备的XPC得率为66.35%,与预测值接近,说明基于响应面法优化工艺可靠。

图2 因素间的交互作用对XPC得率的影响

Figure 2 Response surface of yield of XPC affected by different variables

2.2.4 铁含量的测定 由标准曲线方程得XPC中铁含量为22.57%。王花等[21]研究的大枣多糖铁复合物中铁含量为20.26%;李玉贤等[23]制备的百合多糖铁中铁(Ⅲ)含量为20.81%;王峰等[24]研究的绞股蓝多糖铁中铁含量为29.14%。结果表明,最佳制备条件下的XPC不仅得率可观,铁含量也较高。

2.3 XPC结构特征

2.3.1 红外光谱分析 由图3可知,Xyl和XPC在3 000 cm-1处有一强烈的吸收峰,为XPC中-OH的伸缩振动吸收,峰的强度和形状的差异表明XPC的结构中有更多的羟基,与金属离子结合后,该吸收峰趋势较陡,说明多糖中的—OH参与了络合反应[25];3 000~2 900 cm-1处存在小的吸收峰,为XPC中C—H的伸缩振动;1 200~1 000 cm-1处的吸收峰是由C—O伸缩振动引起的;但在XPC光谱中有两个峰值显示一些迁移(1 633,1 045 cm-1),表明铁(Ⅲ)和Xyl有被羟基结合的可能[4];碳水化合物指纹区1 000~400 cm-1处的吸收带对XPC的变化敏感;862 cm-1处有一特殊吸收峰,与文献[26]报道的β-FeOOH的特征吸收一致,表明XPC中的铁都是以聚合的β-FeOOH铁核结构存在的。

图3 XPC和Xyl的红外图谱

Figure 3 The infrared spectroscopy spectrum of XPC and Xyl

2.3.2 X-射线衍射分析 由图4可知,Xyl和XPC未出现尖锐的吸收峰,修饰前后粉末衍射图谱趋势基本一致,说明形成复合物后,未破坏多糖结构的基本骨架。XPC未呈现晶体的趋势,结构基本上是无定形的,与文献[27]基本一致。此外,XPC的X-射线衍射图谱不含FeCl3中的特征衍射峰,表明铁(Ⅲ)可以与Xyl螯合并广泛分散在糖链中。

2.4 抗氧化活性分析

由图5可知,XPC对DPPH自由基的清除活性较显著,当样品浓度为0.1~2.0 mg/mL时,XPC对DPPH自由基的清除能力呈现一定剂量效应,随样品浓度的增高而增大;当样品浓度为2.0 mg/mL时,XPC对DPPH自由基的清除率达到最大值73.44%,比Xyl的高64.48%。当样品浓度为0.1~2.0 mg/mL时,XPC对超氧阴离子的清除率随样品浓度的增高而增大;当样品浓度为2.0 mg/mL时,XPC对超氧阴离子的清除率高达30.95%,比Xyl的高37.20%。XPC对清除羟基自由基的能力随样品浓度的增高而增大,当样品浓度为2.0 mg/mL时,其对羟基自由基的清除率为22.72%,比Xyl的高26.36%。当样品浓度为0.1~2.0 mg/mL时,Xyl和XPC均具有一定的还原能力,随着样品浓度的增高其还原能力不断增强,但变化不明显,与文献[28]中大分子量的水溶性大豆多糖铁还原能力相似。研究[28]表明,Xyl自身具有一定的抗氧化活性,与三价铁离子螯合后,其抗氧化活性显著增加,可能与三价铁与Xyl共轭引起的结构和分子量的变化有关。据报道[27],相较于多糖自身,合成的平贝母多糖铁配合物抗氧化活性显著增加,与试验结果相似,可能是Xyl结构中的羟基与三价铁离子螯合形成复合物,使其抗氧化活性增强[29]

图4 FeCl3、Xyl及XPC的X-射线衍射图谱

Figure 4 The X-ray diffraction patterns of FeCl3, Xyl and XPC

图5 XPC的抗氧化活性

Figure 5 Antioxidant activity of XPC

3 结论

以木聚糖为原料,与FeCl3螯合形成木聚糖—铁复合物,通过响应面法优化以确定木聚糖—铁复合物的制备工艺。结果表明,最佳制备木聚糖—铁复合物的工艺条件为木聚糖与柠檬酸钠质量比3∶1,制备温度70 ℃,pH 8.0,木聚糖—铁复合物得率为66.35%,含铁量为22.57%。红外光谱和X-射线衍射分析表明Fe3+成功与木聚糖螯合,形成了稳定的复合物,结构呈无定形状态。木聚糖分子中存在大量的羟基,由于与铁离子螯合,木聚糖—铁复合物的抗氧化活性明显高于木聚糖。后续可采用动物试验进一步研究木聚糖—铁复合物的毒性和生理功能特性,对木聚糖—铁复合物能否开发为一种新型补铁剂具有重要意义。

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Optimization on preparation technology of xylan polysaccharides iron complex and its antioxidant activities

(1.College of Chemistry and Bioengineering, Guilin University of Science and Technology, Guilin, Guangxi 541006, China; 2.Guangxi Botanical Research Institute, Guilin, Guangxi 541006, China; 3.Hunan Agricultural Product Processing Institute, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha, Hunan 410125, China)

AbstractTaking xylan(Xyl)and ferric chloride as substrates, the effects of the mass ratio of Xyl to sodium citrate, reaction temperature and pH on yield rate was investigated by single factor test.Preparation technology of xylan polysaccharides iron complex(XPC)was optimized by response surface methodology.The preliminary structure characterization of Xyl and XPC was performed by infrared spectroscopy and X-ray diffraction.The DPPH free radical, superoxide anion, hydroxyl radical and reducing power of XPC was also studied.The results showed that the optimum preparation conditions were as follows: the mass ratio of Xyl to sodium citrate of 3∶1, reaction temperature of 70 ℃ and pH of 8.0.Under the optimal conditions, the yield of XPC was 66.59%, and the iron content was 22.57%.Infrared spectroscopy and X-ray diffraction confirmed that iron(III)ions were successfully chelated with Xyl without destroying its basic framework.The maximum scavenging rates of XPC to DPPH, hydroxyl and superoxide anion radicals were 73.44%, 30.95% and 22.72%, respectively.Compared with Xyl, the antioxidant activities of XPC significantly increased.

Keywordsxylan; iron complex; structure characteristics; antioxidant activity

基金项目:国家自然科学基金地区基金(编号:31860251)

作者简介:李霞,女,桂林理工大学教授,博士。

通信作者:

关媛(1989—),女,桂林理工大学讲师,博士。

E-mail:2019017@glut.edu.cn

收稿日期:2019-12-20

DOI10.13652/j.issn.1003-5788.2020.03.039