大肠杆菌工程菌产木聚糖酶工艺优化及酶学性质研究

刘国锋1,2LIU Guo-feng1,2

(1.湖南尤特尔生化有限公司,湖南 岳阳 414000;2.山东尤特尔生物科技有限公司,山东 邹城 273500)

摘要:对大肠杆菌工程菌产木聚糖酶的工艺进行优化,并对木聚糖酶的酶学性质进行研究。确定了提取工艺路线,即依次经过细胞破碎(高速珠磨法)、固液分离及除菌(中空纤维膜过滤)、超滤浓缩及烘干包衣步骤后得到肠溶木聚糖酶产品。该产品热稳定性好,在pH 2.5磷酸盐缓冲液中释放度为5.0%,在pH 5.5磷酸盐缓冲液中释放度为98.5%,产品外观光泽性好,能够很好地满足饲料酶市场要求。该木聚糖酶的最适pH值为6.4,最适温度为55 ℃。该酶具有较好的热稳定性,含水分17%的酶在90 ℃条件下2.5 min 仅失活13.6%。对木聚糖酶降解产物进行检测表明该木聚糖酶是一种内切酶。

关键词:木聚糖酶;大肠杆菌;酶学性质

木聚糖酶(1,4-β-D-xylan xylanohydrolase,EC.3.2.1.8)是一类木聚糖降解酶系,属于水解酶类。木聚糖酶主要包括:内切β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。狭义上的木聚糖酶是指β-1,4-内切木聚糖酶[1-2]。木聚糖酶可用于生物乙醇的生产,在食品、饲料等行业中也有着广泛的应用[3]

木聚糖酶是饲料主要用酶之一,其主要作用是分解由五碳糖聚合而成的半纤维素和木聚糖,主要分解产物有木糖、木二糖、木三糖和少量的阿拉伯糖。在食品工业中木聚糖酶也有着比较广泛的应用,在面包加工过程中添加适量的木聚糖酶不仅能提高面团的机械加工性能,还可以消除发酵过度的影响,增大面包体积,改善面包芯质地以及延缓老化[4]。另外,近年来木聚糖酶广泛用于酶法生产低聚木糖上,作为功能性低聚糖的一种,低聚木糖在保健食品和医药行业有广泛的应用前景,对高脂血症有很好的治疗效果,能有效地降低血压、血清胆固醇[5]。目前,对木聚糖酶的研究侧重于高产木聚糖酶基因工程菌的构建、木聚糖酶诱导表达优化、木聚糖酶功能基因的鉴定及比较等方面[6-8]。中国生产木聚糖酶的厂家较少,因酶活力单位较低,质量不稳定,木聚糖酶产品主要依靠进口。因此开发高活性的木聚糖酶对打破国外厂家垄断、提高企业经济效益方面具有广阔的前景。本试验拟在前期研究[9]的基础上,对工程菌产木聚糖酶提取工艺进行探究,并对获得的木聚糖酶的酶学性质进行研究,以期为木聚糖酶工业化大生产提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

大肠杆菌工程菌发酵液:湖南尤特尔生化有限公司;

丙烯酸树脂:生化试剂,辽宁三环树脂有限公司;

中空纤维膜:PWSW-543(0.1 μm,0.08 m2)、UMP153(0.2 μm,0.08 m2)、ULP143 (0.45 μm,0.1 m2),颇尔过滤器(北京)有限公司;

陶瓷膜、陶瓷超滤膜管单孔道(0.2 μm,0.08 m2):合肥世杰膜工程有限责任公司。

1.1.2 主要仪器设备

精密pH计:雷磁PHS-3C型,上海仪电科学仪器股份有限公司;

电热恒温鼓风干燥箱:DHG-9140A型,上海精宏实验设备有限公司;

水分快速测定仪:SH10AD型,上海良平仪器有限公司;

浊度测定仪:XZ-0101型,上海海恒机电仪表有限公司;

管式连续流离心机:GQ145WZ型,上海佳毅机械设备公司;

板框压滤机:1000型,佛山金凯地过滤设备有限公司;

电热恒温水浴锅:HH-8型,常州国华电器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生产工艺流程

大肠杆菌→摇瓶种子→小罐种子→发酵罐发酵→细胞破碎→中空纤维膜过滤→超滤浓缩→固液混合→摇摆造粒→抛丸→烘干→筛分→包衣→配制→检验→包装→成品

1.2.2 酶的提取工艺

(1) 珠磨法提取木聚糖酶的工艺:将发酵液冷却至18 ℃ 后,以同一进料速度连续流入DYNO-mill ECM珠磨机中,在不同直径大小的研磨珠及其装填系数下进行细胞破碎,检测破碎液酶活。以实验室超声波破碎发酵液测得的酶活为参照,按式(1)计算细胞破碎率。

(1)

式中:

C1——细胞破碎率,%;

U1——珠磨机破碎液酶活,IU;

U2——超声波破碎液酶活,IU。

(2) 膜分离设备选型及工艺参数优化:选用PWSW-543(0.1 μm,0.08 m2)、UMP153(0.2 μm,0.08 m2)、ULP143 (0.45 μm,0.1 m2) 3种型号的膜柱,采用恒压过滤模式进行酶制剂澄清过滤。

膜柱化学清洗方法:试验结束后,用冷水、55 ℃热水冲洗,再使用1%的碱+300 mg/L过氧化氢在55 ℃清洗10 min。清洗完毕后,通过中空纤维膜柱水通量恢复率来考察中空纤维膜堵塞程度,浊度用浊度测定仪测定。

(3) 超滤浓缩木聚糖酶的工艺研究:将截留分子量为5 000,8 000,10 000,20 000 D聚醚砜(PES)卷式超滤膜分别装入超滤机中,取适量的中性木聚糖酶倒入超滤桶中,在20 ℃ 同条件下进行浓缩。分别测定超滤透过液酶活、浓缩液酶活,按式(2)计算超滤收率。

(2)

式中:

C2——超滤收率,%;

U3——超滤透过液酶活,IU;

U4——浓缩液酶活,IU。

(4) 固态肠溶木聚糖酶包衣材料选择:在槽型混合机中将浓缩酶液、玉米淀粉、糊精、磷酸氢二钠及磷酸二氢钠按照一定比例混合均匀,送入摇摆式颗粒机进行摇摆造粒。将成型后的颗粒使用抛丸机抛圆。将抛圆后的光滑小丸用沸腾干燥制粒机在50 ℃下干燥。将干燥后的小丸用振动筛分选出30~80目的小丸。将不同型号的聚丙烯树脂放入95%酒精中,按1∶20的质量比混合配制成肠溶包衣材料。将分选出的小丸放入旋流流化床包衣机中,用包衣机配枪把配制的不同肠溶包衣材料均匀喷洒到小丸上,50 ℃下干燥制得固态肠溶木聚糖酶。将肠溶酶置于80 ℃ 5 min、pH 2.5磷酸缓冲液120 min、pH 5.5磷酸缓冲液15 min条件下测酶活。

1.2.3 酶学性质的研究

(1) 木聚糖酶最适pH值和最适温度的确定:测定木聚糖酶在不同pH(3.2~9.6)及不同温度(35~70 ℃)条件下的酶活。酶活力单位(IU)规定为:温度50 ℃、pH 6.5条件下,每分钟从浓度为5.0 mg/mL的榉木木聚糖溶液中产生1 μmol 还原糖所需要的酶量,还原糖(采用斐林法测定[10])以木聚糖含量计。木聚糖酶酶活的测定:参照文献[11]。

(2) 酶的热稳定性测定:将酶液分别在40,50,60,70 ℃水浴中放置不同时间后,在pH 6.5、50 ℃条件下测定酶活。准确称取1.000 g样品,加入10 mL水(加水后总含水量17%),充分搅拌后盖严,于90 ℃恒温干燥箱处理2.5,5.0,7.5,10.0 min,立即提取,在pH 6.5、50 ℃条件下测定酶活。

(3) 木聚糖酶降解产物研究:用薄层色谱法鉴定pH 6.5、50 ℃条件下燕麦木聚糖经木聚糖酶降解后的产物种类。

2 结果与讨论

2.1 珠磨法工艺参数优化

胞内产物的提取首先需要对细胞进行破碎,细胞破碎方法的选择直接影响产品品质及生产成本。近年来常用的几种细胞破碎方法有高压匀浆法、高速珠磨法、超声破碎、酶溶法及化学渗透法[12]。本研究采用高速珠磨法。

从表1可以看出,在相同装填系数条件下,研磨珠直径越小,破碎率越高,但电能消耗也递增。在相同直径条件下,研磨珠装填系数越高,破碎率越高,但电能消耗也递增。选择第5组工艺参数,破碎效果较好,生产能耗也相对较低。

1 研磨珠直径及装填系数对破碎效果的影响
Table 1 The effect of the grinding bead diameter and filling coefficient on the breaking effect

分组研磨珠直径/mm装填系数/%破碎率/%电动机电流大小/A10.2~0.47094.03520.2~0.48598.83830.2~0.49099.04040.6~0.87093.02850.6~0.88598.53060.6~0.89098.63571.0~1.57085.02681.0~1.58593.02891.0~1.59093.233

在实际生产过程中发现,细胞破碎次数越多,细胞破碎率越高,但不是无限增大的。当破碎1次后破碎近乎完全时,考虑到经济性和避免生产操作的复杂,再增加破碎次数是不必要的,因此选择破碎1次。

2.2 固液分离方法选择

在固液分离过程中,工业上常用的设备有离心机、板框压滤机、真空转鼓过滤机及膜过滤系统[13]。本研究选用管式连续流离心机(10 000 r/min)、板框压滤机、陶瓷膜系统、中空纤维膜系统对细胞破碎液进行初步测试,结果见表2。

从表2可以看出,选用陶瓷膜系统和中空纤维膜系统处理细胞破碎液比较好。另外,膜过滤系统还能达到一次性过滤澄清物料并去除细菌的效果。

2.3 膜分离方法选择

在前面的试验基础上,按照1.2.2(2)对细胞破碎液进行进一步过滤测试,结果见表3。

从表3可以看出,陶瓷膜孔径受加工精度的影响,透过液可以检测出细菌,其滤出液酶活较同孔径大小的中空纤维膜透过液酶活低。另外,在酶的收率方面,选用陶瓷膜的收率只有75%,小于中空纤维膜的,主要是陶瓷膜系统运行所需压力较中空纤维膜系统高,酶受剪切力作用大,导致陶瓷膜系统所得收率较中空纤维膜系统收率小。

2 几种固液分离方法初步测试结果
Table 2 The initial test results of several kinds of solid-liquid separation method

分离方法结果管式连续流离心机离心后出来液体不澄清板框压滤机滤出液澄清,但过滤衰减快,过滤处理总量少,劳动强度高管式连续流离心机+板框压滤机滤出液澄清,但过滤速度慢,过滤时间长,劳动强度高陶瓷膜系统透过液澄清,操作简便,劳动强度低中空纤维膜系统透过液澄清,操作简便,劳动强度低

为进一步选择合适的中空纤维膜型号,按照1.2.2(2)分别进行了测试,结果见表4和图1、2。

从表4和图2中可以看出,中空纤维膜膜柱UMP153和膜柱ULP143在恒定过膜压力0.05 MPa条件下过滤酶液,实际过滤时间分别为1 h 43 min和1 h 5 min,平均通量分别为10.9,16.6 L/(m2·h)。膜柱经过清洗后,水通量恢复率分别为94%,100%。可见,膜柱ULP143过滤酶液,收率高,通量理想,透过液质量满足控制要求。膜柱采用冷水、55 ℃热水、55 ℃ 1%的碱液+300 mg/L 过氧化氢上下游同时清洗工艺,可恢复滤膜水通量。因此,后续生产中选用膜柱ULP143中空纤维膜用于固液分离工段。

图1 细胞破碎液、透过液(膜柱ULP143)和浓缩液浊度比较
Figure 1 The comparision of the turbidity of cell disruption liquid, penetration liquid (film column ULP143) and concentrate liquid

3 不同类型膜过滤系统测试结果
Table 3 The test results of different types of filtration system

膜型号细胞破碎液浊度/NTU透过液浊度/NTU原料酶活/(IU·mL-1)透过液酶活/(IU·mL-1)收率/%平均通量/(L·m-2·h-1)细菌总数/(CFU·mL-1)陶瓷膜-14.312400010500075.018.285000中空纤维膜ULP143-12.012400012100097.516.80

† “-”表示细胞破碎液浊度超过仪器检测上限。

4 膜柱UMP153及膜柱ULP143测试结果
Table 4 The test results of film column UMP153 and film column ULP143

膜型号细胞破碎液浊度/NTU透过液浊度/NTU原料酶活/(IU·mL-1)透过液酶活/(IU·mL-1)收率/%平均通量/(L·m-2·h-1)细菌总数/(CFU·mL-1)中空纤维膜UMP153-10.21200009300093.510.90中空纤维膜ULP143-12.212000011800097.616.60

† “-”表示细胞破碎液浊度超过仪器检测上限。

图2 UMP153和ULP143过滤过程通量、温度随透过液体积的变化趋势
Figure 2 The variation trend of flux and temperature with the volume of penetration liquid in the UMP153 and ULP143 filtration process

2.4 酶液浓缩方法选择及工艺参数优化

工业生产上常用的酶液浓缩方法有盐析法、冷冻干燥浓缩法、真空薄膜浓缩法、超滤膜浓缩法[14]。从能耗、环保、提取收率及生产操作等方面考虑,采用超滤膜浓缩法用于工业化大生产。本研究中,木聚糖酶分子量为30 kD,选用不同超滤膜孔径进行浓缩测试,结果见表5。

从表5可以看出,超滤膜PES20透过的废液通量最大,但废液酶活也最高,提取收率受到影响。超滤膜PES5透过的废液酶活最低,但废液通量最小,因酶液循环次数多酶蛋白受超滤系统剪切力破坏多,提取收率受到较大影响。超滤膜PES10超滤浓缩酶液,透过的废液酶活、通量及超滤收率在4组超滤膜中比较理想,能够满足生产控制要求。因此,选用超滤膜PES10用于超滤浓缩工段。

2.5 固态肠溶木聚糖酶包衣材料选择

酶作为饲料添加剂在饲料中得到大量使用。饲用肠溶酶相对颗粒酶在表面设计一层隔水膜,使其在饲料制粒的过程中可以免除高温水蒸气引起的酶失活,增加了酶的湿热稳定性。另一方面,这层隔水膜在强酸性环境中不会崩解,可以保证包含其内的生物酶顺利通过动物胃环境而不失活,最后到达偏中性的小肠定点释放发挥作用。因而,固态肠溶木聚糖酶具有广阔的市场前景,而生产固态肠溶木聚糖酶的关键在于包衣材料的选择。分别选取肠溶性I、Ⅱ、Ⅲ号丙烯酸树脂作薄膜包衣材料包衣后,将产品进行高温及释放度测试,结果见表6。

由表6中可以看出,考虑到酶活和颗粒外观的特性,选择Ⅱ和Ⅲ号丙烯酸树脂继续进行包衣优化试验。将Ⅱ和Ⅲ号丙烯酸树脂按照不同比例作薄膜包衣材料包衣后,将产品进行高温及释放度测试,结果见表7。由表7可知,Ⅱ和Ⅲ号丙烯酸树脂按照质量比1∶1进行包衣后,产品酶活达到了98.5%、颗粒外观光泽性好、包衣过程中不易黏连,能够满足生产控制要求。

5 不同孔径超滤膜超滤测试结果
Table 5 The test results of different aperture ultrafiltration membrane

膜类型截留分子量/D原料液酶活/(IU·mL-1)废液酶活/(IU·mL-1)平均通量/(L·m-2·h-1)超滤收率/%PES5500080000501.273.6PES880008000010010.092.4PES10100008000038028.898.5PES2020000800001300037.570.5

6 不同型号包衣材料测试结果
Table 6 The test results of different types of coating material

型号酶活保存率/%80℃5minpH2.5磷酸盐缓冲液120minpH5.5磷酸盐缓冲液15min颗粒外观I95.055.095.0外观光泽性差,包衣过程中易黏连Ⅱ98.85.098.5外观光泽性差,包衣过程中不易黏连Ⅲ98.36.896.0外观光泽性好,包衣过程中易黏连

7 不同比例包衣材料测试结果
Table 7 The test results of different propotion of coating material

Ⅱ︰Ⅲ(质量比)酶活保存率/%80℃5minpH2.5磷酸盐缓冲液120minpH5.5磷酸盐缓冲液15min颗粒外观2︰198.85.098.5外观光泽性差,包衣过程中不易黏连1︰198.55.098.5外观光泽性好,包衣过程中不易黏连1︰298.55.898.2外观光泽性好,包衣过程中易黏连

2.6 木聚糖酶的酶学性质研究

2.6.1 木聚糖酶最适条件研究 酶的酶学性质对酶的工业化应用具有重要的作用,酶的最适pH和最适反应温度是酶的重要性质,本研究对木聚糖酶在不同pH和温度下的酶活力进行了测定,结果见图3。由图3(a)可看出,木聚糖酶活力随着pH的增加呈现先增加后降低的趋势,pH为6.4时木聚糖酶活力达到最高。因此,确定木聚糖酶的最适pH为6.4。

由图3(b)可知,该木聚糖酶的酶活在低于55 ℃下呈缓慢上升趋势,当温度高于55 ℃后酶活急剧降低,温度为55 ℃ 时酶活力最高。

2.6.2 木聚糖酶热稳定性研究 由图4可看出,该木聚糖酶在40~50 ℃条件下4 h能100%保持活性,含水量17%的酶在90 ℃条件下2.5 min仅失活13.6%,该木聚糖酶具有较好的热稳定性。同干热处理相比,湿热处理对酶活的影响要大得多,与其他研究者[15-16]得出的结论一致。说明在相同温度条件下湿热环境更不利于木聚糖酶保持活力。

2.7 木聚糖酶降解产物的研究

用薄层色谱法测定了收集到的燕麦木聚糖降解产物S1、S2、S3和S4,结果见图5。由图5可知,降解产物S1中包含木糖和木二糖;降解产物S2中包含木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖;降解产物S3主要为葡萄糖;降解产物S4主要为阿拉伯糖。降解产物主要包括木二糖、木三糖、木四糖和木五糖,这4种糖占降解产物总量的90%以上,充分说明该木聚糖酶是一种内切酶。

图3 pH和温度对酶活力的影响
Figure 3 The effect of pH and temperature on the enzyme activity

图4 酶的湿热稳定性和含水量为17%时在90 ℃的热稳定性
Figure 4 The curve of hydrothermal stability of enzyme and the themal stability of the enzyme with 17% water content under 90 ℃

A.阿拉伯糖 G.葡萄糖 X1.木糖 X2.木二糖 X3.木三糖 X4.木四糖 X5.木五糖

图5 酶对燕麦木聚糖的降解产物
Figure 5 The production from the degradation of oat spelt xylan by xylanase

3 结论

本试验对大肠杆菌工程菌产木聚糖酶提取工艺进行了优化,并对获得的木聚糖酶酶学性质进行了研究。主要结论如下:

(1) 确定了木聚糖酶的提取工艺路线,在pH 2.5磷酸盐缓冲液释放度为5.0%,在pH 5.5磷酸盐缓冲液释放度为98.5%,产品外观光泽性好,能够很好地满足市场对木聚糖酶的要求,因此该酶可以作为工业化产品投放市场。

(2) 酶学性质研究表明该酶是一种以内切作用为主的木聚糖酶,最适pH值为6.4,最适温度为55 ℃,该酶具有较好的热稳定性,含水分量17%的酶在90 ℃条件下2.5 min仅失活13.6%。该木聚糖酶具有很好的酶学性质。

(3) 目前木聚糖酶的生产和应用具有很大的空间,下一步将考虑拓宽木聚糖酶在工业方面的应用范围。

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Study on technology and enzymatic property of xylanase produced from engineered Escherichia coli

(1.Hunan Youtell Biochemical Co., Ltd., Yueyang, Hunan 414000, China; 2.Shandong Youtell Biochemical Co., Ltd., Zoucheng, Shandong 273500, China)

Abstract: In this study, the extraction technology and enzymatic property of xylanase produced from engineered Escherichia coli are fully examined.The extraction of production process of xylanase was determined and the forage enteric xylanase was successfully obtained after cell broken (high-speed ball grinding), solid-liquid separation, aseptic (filtering) hollow fiber membrane, ultrafiltration concentra-tion and drying packaging orderly.This production showed desirable thermal stability and its release rate was 5% and 98.5% in pH 2.5 and pH 5.5 phosphate buffer, respectively.The product appearance exhibited good gloss and it could meet the requirements of feed enzyme market well.The xylanase showed the maximal activity at pH 6.4 and 55 ℃, and xylanase with 17% water content just lost 13.6% activity at 90 ℃ after dealing with for 2.5 min.By measuring the oat spelt xylan degradation products, the enzyme was revealed to be a kind of Endo-xylanase.

Keywords: xylanase; Escherichia coli; enzymatic property

基金项目:科技型中小企业技术创新项目(编号:14C26213701984)

作者简介:刘国锋(1980—),男,湖南尤特尔生化有限公司工程师,硕士。E-mail:22028154@qq.com

收稿日期:2017-10-25

DOI:10.13652/j.issn.1003-5788.2018.02.006