EMS-ARTP复合诱变选育高产DHA裂殖壶菌

赵 犇1

王 武1

李昌灵2

杨海麟1

(1.江南大学生物工程学院教育部工业微生物技术重点实验室,江苏 无锡 214122;2.怀化学院生物与食品工程学院,湖南 怀化 418000)

摘要:为确定一种高效、稳定的选育高产DHA裂殖壶菌菌株的方法,将出发菌株Schizochytrium sp.31进行甲基磺酸乙酯(EMS)诱变和常压室温等离子体(ARTP)复合诱变,并将复合诱变方法与2种单因子诱变方法进行诱变效率、诱变后高产株发酵特性及遗传稳定性比较。结果显示,该复合诱变正突变率达到32.2%,远高于2种单因子诱变方法;复合诱变选育得到高产DHA裂殖壶菌菌株,其DHA生产能力和DHA含量分别达到7.2 g/L和43.2%,比出发菌株分别高35.6%和19.2%;经过5代培养,其发酵指标稳定,遗传稳定性优于单因子诱变获得的菌株。该复合诱变方法是选育高产DHA裂殖壶菌菌株的有效手段,也为其它产多不饱和脂肪酸菌株的选育提供了参考。

关键词:裂殖壶菌;DHA;诱变;常压室温等离子体(ARTP);甲基磺酸乙酯(EMS);复合诱变

随着世界范围内能源和资源的日益紧张,可再生能源与资源的研究与开发已成为关注热点。近几年,各国纷纷开始在微藻生物燃料和营养化学品领域谋求突破与发展:美国能源部宣布将投资1 800万美元用于藻类生物燃料与生物基产品研究;欧盟也积极投资藻类研究,旨在示范从藻种选育、培养条件优化、油脂提取、生物燃料生产等过程[1]。微藻在食品资源方面的利用涉及到裂殖壶菌,又称裂壶藻,是属于破囊壶菌科的单细胞海洋微藻,在一定的培养条件下,裂殖壶菌胞内油脂中二十二碳六烯酸(DHA,C22:6)含量较高,是值得研究和深度开发的生物合成DHA的优质种源[2]

DHA为ω-3多不饱和脂肪酸,是一种重要的食品添加剂。它是大脑和视网膜的重要组成成分,还具有抗癌、消炎、预防心血管疾病等诸多功能[3-4],其保健和医疗功效越来越受到重视。与传统的深海鱼油生产DHA的方式相比,裂殖壶菌发酵生产DHA具有培养简单、无季节波动、目的产物含量比高、无污染、无鱼腥味、成本低、不影响海洋生态等优点[5],裂殖壶菌发酵生产DHA开始进入了工业化阶段[6]

近些年,不断见到优化裂殖壶菌发酵,提高DHA产量的研究报道,如发酵培养基优化[7-9]、pH调控[10-11]、溶氧调控[12-14]、补料策略优化[15]等,靠传统发酵策略提高DHA的发酵生产强度的余地越来越小。而借助遗传育种手段,培育高产DHA的裂殖壶菌变异株仍有一定的发展空间,这也是发酵法提高DHA生产强度的上游基础。

裂殖壶菌基因组约39 Mb[16],且裂殖壶菌代谢体系中脂肪酸合成途径复杂,既存在短链饱和脂肪酸的脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FAS)合成途径,又存在长链不饱和脂肪酸的聚酮合酶(polyketide synthase, PKS)的合成通路[17]。尽管基因工程已普遍应用于微生物育种,并且在裂殖壶菌上也有所研究[18-19],但考虑到裂殖壶菌复杂的遗传背景和尚不十分明晰的DHA合成途径,物理和化学诱变仍旧是可以考虑的选择。

甲基磺酸乙酯(EMS)诱变为化学诱变,其作用机制是对DNA上高密度的碱基进行烷化作用,形成转换型或置换型突变[20]。目前EMS诱变在微生物育种以及农作物的优良品种选育上广泛应用,并获得了不错的效果[21-22]。常压室温等离子体(ARTP)是一种新型的诱变技术,它利用大气压辉光放电,产生多种活性粒子,作用于DNA上,引发基因突变[23],它具有操作简单、可控性强、诱变效果好的特点,已逐步开始在科研与工业领域发挥重要作用[24]。由于单种诱变方法往往会使菌种产生抗性,或得到的诱变菌株性能不够稳定,在实际应用中往往采用2种或多种诱变方式相结合的方法进行诱变,即复合诱变[25]

裂殖壶菌具有多层的细胞壁结构保护着胞内物质[26],DHA的合成途径与代谢机制又十分复杂。以往针对裂殖壶菌的育种手段往往采用单一的诱变方法,这会产生诱变效果差、诱变效率低或诱变株性能不稳定、易退化等问题,如吕晓义等[27]仅仅利用60Co-γ射线辐照诱变裂殖壶菌,获得的诱变菌产量只有5.65 g/L;梁园梅等[28]采用单一UV诱变育种,获得的诱变株性能也没有突出的提升。欲获得性状良好、遗传稳定的裂殖壶菌高产DHA变异株,本研究将EMS-ARTP复合诱变方法应用于裂殖壶菌诱变育种,以期获得裂殖壶菌高产DHA诱变菌。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

菌株:裂殖壶菌(Schizochytrium sp.S31,ATCC 20888),美国菌种保藏中心;

脂肪酸:标准品,美国Sigma公司;

正己烷:HPLC级,美国Fisher公司;

其他试剂:分析纯,国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

离心机:3K15型,德国Sigma公司;

分光光度计:T6新世纪型,北京普禧通用仪器有限公司;

ARTP诱变仪:ARTP-III型,北京思清源生物科技有限公司;

气相色谱仪:GC-2010型,日本岛津公司。

1.1.3 培养基

790 By+固体培养基:葡萄糖5 g/L、胰蛋白胨1 g/L、酵母粉1 g/L、琼脂20 g/L、海水晶17.5 g/L,121 ℃ 灭菌20 min;

种子培养基:葡萄糖30 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、海水晶15 g/L、VB1 0.05 g/L、VB6 0.05 g/L、VB12 0.000 5 g/L,115 ℃灭菌20 min;

发酵培养基:葡萄糖100 g/L、胰蛋白胨5.6 g/L、谷氨酸钠20 g/L、磷酸二氢钾2.5 g/L、硫酸镁7.2 g/L、硫酸钠 12.8g/L、氯化钙 0.4 g/L、海水晶17.5 g/L、VB1 0.1 g/L、VB6 0.1 g/L、VB12 0.001 g/L,115 ℃灭菌20 min;

0.2 mol/L PBS缓冲液(pH 7.2):用双蒸水分别溶解24.00 g 磷酸二氢钠和28.39 g磷酸氢二钠至1 000 mL,然后混合280 mL磷酸二氢钠溶液和720 mL磷酸氢二钠溶液,121 ℃灭菌20 min,备用;

EMS溶液:取5 mL EMS原液,加入到15 mL预冷的乙醇溶液中,加盖并轻轻转动试管混合均匀。

1.2 方法

1.2.1 裂殖壶菌诱变菌株制备

(1) 菌悬液制备:将裂殖壶菌接种于装有50 mL种子培养基的250 mL摇瓶中,28 ℃、200 r/min培养2 d。取1 mL培养液3 000 r/min离心5 min收集菌体,用PBS缓冲液洗涤2次后稀释至OD540为0.6~0.7(以PBS缓冲液为参比管)。

(2) EMS诱变株制备:在10 mL菌悬液中加入400 μL EMS溶液,轻轻摇匀后置于摇床,28 ℃、200 r/min条件下分别处理0,10,20,30,40,50,60 min(0 min为对照组),取出后用5%硫代硫酸钠溶液洗涤2~3次终止反应,细胞用PBS缓冲液悬浮后吸取100 μL均匀涂布于固体培养基平皿上,置于30 ℃避光培养4 d。

(3) ARTP诱变株制备:吸取20 μL菌悬液,均匀涂抹在灭过菌的载物铁片上,将铁片置于ARTP诱变仪载物台上,用高纯氦气等离子体诱变分别处理0(对照组),5,10,15,20,25 s,诱变参数为:电源功率100 W,氦气流量10 L/min,照射距离2 mm。ARTP诱变处理后,将铁片转移至装有1 mL PBS缓冲液的EP管中,震荡洗脱菌体。吸取100 μL菌体悬浮液均匀涂布于固体培养基平皿上,置于30 ℃避光培养4 d。

(4) EMS-ARTP复合诱变菌制备:将EMS诱变处理40 min 后制备的诱变菌悬液吸取100 μL均匀涂布于固体培养基平皿上,置于30 ℃避光培养4 d。混合平皿上长出的单菌落,并挑取一环,接种于装有50 mL种子培养基的250 mL摇瓶中,按1.2.1(1)制备菌悬液,然后按1.2.1(3)经ARTP照射诱变15 s,获得EMS-ARTP复合诱变菌。其中对照组EMS处理时间0 min,ARTP照射时间0 s。

1.2.2 致死率、突变率计算

(1) 致死率计算:各诱变试验中,对对照组和诱变组固体培养基平皿上长出的菌落进行计数。按式(1)计算致死率。

(1)

式中:

rL——致死率,%;

N0——对照组菌落数;

Nm——诱变组菌落数。

(2) 突变率计算:各诱变试验中,选取致死率为80%~90%的处理时间作为最终诱变时间。在该诱变时间下对裂殖壶菌进行诱变处理,平板培养4 d后各组随机挑选50株菌,摇瓶培养120 h后测DHA产量,记产量高于原始菌株10%的诱变株为正突变株,产量低于原始菌株10%的诱变株为负突变株,并按式(2)计算突变率。

(2)

式中:

rm——突变率,%;

rP——正突变率,%;

rN——负突变率,%;

NP——正突变株菌株数;

NN——负突变株菌株数。

1.2.3 分析方法

(1) 生物量测定:各诱变株摇瓶培养120 h后,取5 mL发酵液于离心管中,8 000 r/min离心15 min,用双蒸水洗涤离心2次,冷冻干燥后称重计算生物量。

(2) 含油量测定:采用磷酸香草醛法[29]

(3) 脂肪酸含量测定:采用气相色谱法[11]

各诱变组选取5株DHA产量最高的菌株,其发酵平均水平作为该诱变方法下得到的高产菌的发酵水平。

2 结果与分析

2.1 诱变剂量的确定

2种诱变方法对裂殖壶菌的致死效应见图1。裂殖壶菌菌体的致死率与EMS处理时间存在明显的正相关效应,当EMS处理时间为40 min时,致死率达到87%。因此,选取40 min作为EMS处理的诱变剂量。

裂殖壶菌菌体的致死率随着ARTP照射时间的延长而显著增加。当照射时间在15 s以上时,致死率曲线趋于平缓,可能是细胞SOS修复机制的激活,突变率开始增加[30]。此时,裂殖壶菌的致死率达到80%以上。因此,选取15 s作为ARTP照射的诱变剂量。

从图1可以看出,对裂殖壶菌诱变的化学处理中,致死率对应于处理时间,形成较为平缓的上升曲线,而物理诱变中,致死率对应于照射时间则显得陡峭,说明准确掌控照射时间点非常重要。

图1 2种诱变方法对裂殖壶菌的致死效应
Figure 1 Lethal effects of 2 mutagenesis factors to Schizochytrium sp.31 (n=3)

2.2 EMS、ARTP和EMS-ARTP处理突变率的对比

分别使用EMS、ARTP和EMS-ARTP复合诱变3种诱变方法对裂殖壶菌进行诱变处理,并对诱变株进行摇瓶培养后测DHA产量,统计正、负突变率,结果见图2。3种诱变方法对裂殖壶菌的诱变效果呈现出一定的差异性。比较2种单因子诱变方法,裂殖壶菌突变率相差不大,介于40%与45%之间,但是在ARTP突变株中,正突变株的数量占到约60%,远高于负突变株;而在EMS突变株中,正、负突变株数量相当。EMS-ARTP复合诱变后,突变率达到55.7%,明显高于2种单因子诱变。其中正突变率达到32.2%,远远高于负突变率。

对裂殖壶菌而言,3种突变方法形成的突变率截然不同。表观上分析,推测EMS-ARTP复合诱变造成了更丰富的突变位点,因此回复突变的频率远远低于单因子诱变。

图2 3种诱变方法对裂殖壶菌诱变处理的突变率
Figure 2 Mutation rate of 3 mutagenesis factors to Schizochytrium sp.31 (n=3)

2.3 高产诱变株的关键发酵指标类比

从3种诱变方法获得的诱变株当中各挑选5株DHA产量最高的菌株,其发酵平均水平作为该诱变方法下得到的DHA高产菌株的发酵水平,结果见表1、2。从表1可知,与出发菌株相比,3种DHA高产菌株的生物量无明显的变化,而在含油量上,均有不同程度的提高,其中EMS诱变高产株含油量提升略高于ARTP诱变的,而复合诱变高产株含油量最高,达到51%。如表2所示,EMS诱变高产株的DHA较出发菌株无明显变化,而ARTP诱变高产株和复合诱变高产株DHA含量均得到了提升,分别约为40%和43%。基于上述变化,最终3种诱变菌的DHA产量均得到了一定程度的提升,其中EMS-ARTP复合诱变高产株的产量达到了7.2 g/L,提升了近36%,效果最明显。

3种DHA高产菌株的脂肪酸组成与出发菌株具有明显的差异,见表2。EMS诱变高产株的主要FAS产物,如C14∶0和C16∶0略有增加,主要PKS产物二十二碳五烯酸(DPA)出现下降现象;而ARTP和复合诱变高产株的FAS产物和PKS产物变化与EMS诱变高产株正好相反,如复合诱变高产株的FAS产物由原始菌株的42.3%下降到38.6%,而PKS产物由原始菌株的44.9%上升到55.2%。

1 不同高产DHA裂殖壶菌诱变株发酵性能分析
Table 1 Analysis of fermentation performances on different high DHA yield Schizochytrium mutants (n=3)

菌株生物量/(g·L-1)含油量/%DHA产量/(g·L-1)w36.41±1.3645.51±2.085.28±0.35mEMS37.01±1.2848.45±2.585.74±0.33mARTP36.82±1.5547.94±2.676.28±0.28mEA36.88±1.2751.15±2.077.16±0.30

† w:原始菌株;mEMS:EMS诱变菌株;mARTP:ARTP诱变菌株;mEA:EMS-ARTP复合诱变菌株。

2 不同高产DHA裂殖壶菌诱变株脂肪酸组成
Table 2 Fatty acids composition of different high DHA yield Schizochytrium mutants (n=3) %

菌株C14:0C16:0C16:1C18:0C18:1DPADHA其它脂肪酸FAS产物PKS产物w15.53±0.4925.24±0.700.55±0.190.34±0.160.65±0.078.73±0.5436.20±1.0912.76±0.6542.31±2.5544.93±1.80mEMS17.77±0.6426.88±0.811.37±0.291.08±0.300.75±0.087.79±0.4736.40±1.097.96±0.2847.85±3.0242.19±1.66mARTP15.13±0.3824.00±0.600.49±0.230.53±0.220.43±0.0413.77±0.8840.43±1.255.22±0.2340.58±2.3754.20±2.25mEA13.15±0.4123.96±0.700.36±0.150.74±0.210.34±0.0312.03±0.7843.15±1.146.27±0.3538.55±2.3555.18±2.20

† w:原始菌株;mEMS:EMS诱变菌株;mARTP:ARTP诱变菌株;mEA:EMS-ARTP复合诱变菌株。

2.4 高产诱变株遗传稳定性

将3种诱变方法获得的高产DHA诱变株进行连续传代培养,考察其遗传的稳定性,结果见图3。经过5代的传代培养,EMS诱变高产株和ARTP诱变高产株的发酵指标都出现了一定程度的退化,而复合诱变高产株的发酵指标保持相对稳定,其DHA含量为42.2%~43.3%,DHA产量为7.0~7.2 g/L,与一代菌无明显差异,遗传稳定性良好。

2.5 诱变方法对裂殖壶菌诱变机理

由3种诱变方法对裂殖壶菌的诱变结果分析可知,EMS产生的诱变效果弱于ARTP,而复合诱变的效果最好。EMS具有烷化DNA碱基的机理,可引发嘌呤和嘧啶转换[22]。在本试验中,EMS诱变高产株的含油量高于出发菌株,但DHA占总脂肪酸的相对含量与出发菌相比相差不大,说明其脂肪酸合成能力得到了提升,但DHA合成的特定代谢途径并未增强。

ARTP诱变为新型的诱变育种方法,它集合了质量、能量和电荷等损伤因素,产生不同的DNA损伤机制,遗传多样性更丰富[31]。Umu-test显示ARTP对基因的损伤能力远高于UV和常规化学诱变方法[32]。ARTP辐射的高活性粒子温度接近室温,不会对菌体产生热致死效应。在本试验中,将ARTP诱变技术应用于裂殖壶菌选育高产DHA菌株,取得了良好的效果,正突变率远远高于负突变率。通过发酵数据和脂肪酸组成的分析可以发现,ARTP高产株的含油量和DHA产量明显提升,而且脂肪酸组成中PKS产物也有了相应的提升,说明诱变株在合成脂肪酸前体物质的相关合成基因和PKS途径的特定基因都有可能发生了变异。

考虑到裂殖壶菌复杂的脂肪酸合成途径,单点或少数几个点的诱变往往不能对DHA的产量产生显著、稳定的改变。将化学诱变和物理诱变相结合,对裂殖壶菌进行EMS-ARTP复合诱变,诱变机制更多样,突变位点更丰富,获得DHA高产菌的概率也更大。通过EMS-ARTP复合诱变得到的高产菌株,DHA产量达到7.2 g/L。李慧玲等[33]采用DES-UV复合诱变结合丙二酸、碘乙酸联合筛选,得到诱变菌株XN001,其DHA产量为5.5 g/L;许永等[34]采用紫外诱变和喹禾灵筛选的方法,筛得的菌株OUC007,其DHA产量为1.2 g/L;袁军等[35]通过ARTP诱变与强氧化剂施压筛选得到的菌种D32,其DHA产量达到7.3 g/L。通过本试验的诱变方法筛选得到的高产诱变菌株,在未使用任何筛选试剂的情况下,已获得较高DHA产量。该产量与近期报道的相同菌种、相同发酵规模的数据相比,已十分具有竞争力(表3)。后期经过合适的筛选方法和发酵培养优化后,有望进一步提高DHA生产能力。

3 不同破囊壶菌DHA产量和DHA含量比较
Table 3 Comparative results of DHA production and percentage among different studies by thraustochytrids

菌种发酵规模发酵时间/hDHA含量/%DHA产量/(g·L-1)参考文献AurantiochytriumlimacinumSR21500mL/5L168/16549.5/72.61.4/20.3[15]Schizochytriumsp.S056250mL14444.47.95[36]Schizochytriumsp.S31250mL/50L61/9623.5/41.86.5/28.9[37]Schizochytriumsp.S31500mL16846.26.5[30]Schizochytriumsp.D32500mL12050.07.3[35]Schizochytriumsp.mEA250mL12043.27.2本研究

图3 高产诱变株传代次数对发酵指标的影响
Figure 3 Effects ofculture passages on fermentation performance of high DHA yield Schizochytrium mutants

3 结论

将EMS-ARTP复合诱变的方法应用于裂殖壶菌诱变选育高产DHA菌株,并对复合诱变获得的DHA高产菌株与单因子诱变高产菌株进行比较分析得出,EMS-ARTP复合诱变高产菌株无论在DHA产量还是在遗传稳定性上,都优于单因子诱变。再加上后期的理性筛选技术及定向施压培养的应用,有望进一步提高裂殖壶菌合成DHA的产率,继而提高工业化生产DHA的效能。

参考文献

[1] 中国科学院.能源科技领域发展观察[M].北京: 科学出版社, 2016: 303-315.

[2] REN Lu-jing, SUN Xiao-man, JI Xiao-jun, et al.Enhancement of docosahexaenoic acid synthesis by manipulation of antioxidant capacity and prevention of oxidative damage in Schizochytrium sp[J].Bioresource Technology, 2017, 223: 141-148.

[3] D'ELISEO D, VELOTTI F.Omega-3 fatty acids and cancer cell cytotoxicity: implications for multi-targeted cancer therapy[J].J Clin Med, 2016, 5(2): 15-43.

[4] HADLEY K B, BAUER J, MILGRAM N W.The oil-rich algaSchizochytrium sp.as a dietary source of docosahexaenoic acid improves shape discrimination learning associated with visual processing in a canine model of senescence[J].Prostaglandins, Leukotrienes, and Essential Fatty Acids, 2017, 118: 10-18.

[5] JIANG Yue, FAN King-wai, WONG Rsz-yeung, et al.Fatty acid composition and squalene content of the marine microalga Schizochytrium mangrovei[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(5): 1 196-1 200.

[6] HAUVERMALE A, KUNER J, ROSENZWEIG B, et al.Fatty acid production inSchizochytrium sp.: Involvement of a polyunsaturated fatty acid synthase and a type I fatty acid synthase[J].Lipids, 2006, 41(8): 739-747.

[7] GAUNT L F, BEGGS C B, GEORGHIOU G E.Bactericidal action of the reactive species produced by gas-discharge nonthermal plasma at atmospheric pressure: A review[J].Ieee Transactions on Plasma Science, 2006, 34(4): 1 257-1 269.

[8] REN Lu-jing, SUN Li-na, ZHUANG Xiao-yan, et al.Regula-tion of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium sp.: effect of nitrogen addition[J].Bioprocess and Biosystems Engineering, 2014, 37(5): 865-872.

[9] SINGH D, BARROW C J, PURI M, et al.Combination of calcium and magnesium ions prevents substrate inhibition and promotes biomass and lipid production in thraustochytrids under higher glycerol concentration[J].Algal Research-Biomass Biofuels and Bioproducts, 2016, 15: 202-209.

[10] GANUZA E, ANDERSON A J, RATLEDGE C.High-cell-density cultivation ofSchizochytrium sp.in an ammonium/pH-auxostat fed-batch system[J].Biotechnology Letters, 2008, 30(9): 1 559-1 564.

[11] ZHAO Ben, LI Ya-fei, MBIFILE M D, et al.Improvement of docosahexaenoic acid fermentation from Schizochytrium sp.AB-610 by staged pH control based on cell morphological changes[J].Engineering in Life Sciences, 2017, 17(9): 981-988.

[12] CHANG Gui-fang, WU Juan, JIANG Cui-hong, et al.The relationship of oxygen uptake rate and k(L)a with rheological properties in high cell density cultivation of docosahexaenoic acid by Schizochytrium sp.S31[J].Bioresource Technology, 2014, 152: 234-240.

[13] LEWIS K D, HUANG Wei-feng, ZHENG Xiao-hui, et al.Toxicological evaluation of arachidonic acid (ARA)-rich oil and dcosahexaenoic acid (DHA)-rich oil[J].Food and Chemical Toxicology, 2016, 96: 133-144.

[14] QU Liang, JI Xiao-jun, REN Lu-jing, et al.Enhancement of docosahexaenoic acid production by Schizochytrium sp.using a two-stage oxygen supply control strategy based on oxygen transfer coefficient[J].Letters in Applied Microbiology, 2011, 52(1): 22-27.

[15] HUANG Ting-yen, LU Wen-chang, CHU I-ming.A fermentation strategy for producing docosahexaenoic acid in Aurantiochytrium limacinum SR21 and increasing C22:6 proportions in total fatty acid[J].Bioresource Technology, 2012, 123: 8-14.

[16] JI Xiao-jun, MO Kai-qiang, REN Lu-jing, et al.Genome sequence of Schizochytrium sp.CCTCC M209059, an effective producer of docosahexaenoic acid-rich lipids[J].Genome Announc, DOI: 10.1128/genomeA.00819-15.

[17] METZ J G, ROESSLER P, FACCIOTTI D, et al.Production of polyunsaturated fatty acids by polyketide synthases in both prokaryotes and eukaryotes[J].Science, 2001, 293(5 528): 290-293.

[18] REN Lu-jing, ZHUANG Xiao-yan, CHEN Sheng-lan, et al.Introduction of omega-3 desaturase obviously changed the fatty acid profile and sterol content of Schizochytrium sp[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(44): 9 770-9 776.

[19] YAN Jin-fei, CHENG Ru-bin, LIN Xiang-zhi, et al.Overexpression of acetyl-CoA synthetase increased the biomass and fatty acid proportion in microalga Schizochytrium[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(5): 1 933-1 939.

[20] 崔清志, 刘晓虹, 陈惠明.EMS诱变技术研究进展[J].湖南农业科学, 2013(5): 7-9, 13.

[21] 敬樊, 王亮明, 武军, 等.利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱导小麦-华山新麦草染色体易位的研究[J].农业生物技术学报, 2015(5): 561-570.

[22] 降云峰, 刘永忠, 李万星, 等.甲基磺酸乙酯诱变技术在大豆育种上的应用[J].园艺与种苗, 2012(6): 12-15.

[23] ZHANG Xue, ZHANG Xiao-fei, LI He-ping, et al.Atmospheric and room temperature plasma (ARTP) as a new powerful mutagenesis tool[J].Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(12): 5 387-5 396.

[24] 张雪, 张晓菲, 王立言, 等.常压室温等离子体生物诱变育种及其应用研究进展[J].化工学报, 2014(7): 2 676-2 684.

[25] 任少雄, 王丹.植物理化复合诱变育种技术研究进展[J].安徽农业科学, 2009(20): 9 345-9 349.

[26] DARLEY W M, PORTER D, FULLER M S.Cell wall composition and synthesis via Golgi-directed scale formation in the marine eucaryote,Schizochytrium aggregatum, with a note on Thraustochytrium sp[J].Archiv Für Mikrobiologie, 1973, 90(2): 89-106.

[27] 吕小义, 付杰, 尹佳, 等.高产DHA裂壶藻突变株的选育[J].中国酿造, 2015(4): 106-109.

[28] 梁园梅, 刘瑛, 李晶晶, 等.高产DHA破囊壶菌Aurantiochytrium sp.PKU#SW7诱变株的筛选[J].微生物学通报, 2016(2): 457-464.

[29] 罗玮, 顾秋亚, 钟湘南, 等.1种快速检测微藻油脂的新方法[J].食品与发酵工业, 2014(12): 165-168.

[30] FU Jie, CHEN Tao, LU Hao, et al.Enhancement of docosahexaenoic acid production by low-energy ion implantation coupled with screening method based on Sudan black B staining in Schizochytrium sp[J].Bioresource Technology, 2016, 221: 405-411.

[31] LI He-ping, WANG Zhi-bin, GE Nan, et al.Studies on the physical characteristics of the radio-frequency atmospheric-pressure glow discharge plasmas for the genome mutation of methylosinus trichosporium[J].Ieee Transactions on Plasma Science, 2012, 40(11): 2 853-2 860.

[32] ODA Y, NAKAMURA S, OKI I, et al.Evaluation of the new system (umu-test) for the detection of environmental mutagens and carcinogens[J].Mutation Research, 1985, 147(5): 219-229.

[33] 李慧玲, 刘永梅.诱变选育高产DHA裂殖壶菌突变株[J].食品科技, 2015(9): 12-16.

[34] 许永, 臧晓南, 徐涤, 等.裂殖壶菌诱变筛选的研究[J].中国海洋大学学报:自然科学版, 2012(12): 54-58.

[35] 袁军, 赵犇, 孙梦玉, 等.常压室温等离子体(ARTP)诱变快速选育高产DHA的裂殖壶菌突变株[J].生物技术通报, 2015(10): 199-204.

[36] CHEN Wei, ZHOU Peng-peng, ZHU Yuan-min, et al.Improvement in the docosahexaenoic acid production of Schiz-ochytrium sp.S056 by replacement of sea salt[J].Bioprocess and Biosystems Engineering, 2016, 39(2): 315-321.

[37] CHANG Gui-fang, GAO Ni-si, TIAN Gui-wei, et al.Improvement of docosahexaenoic acid production on glycerol by Schizochytrium sp S31 with constantly high oxygen transfer coefficient[J].Bioresource Technology, 2013, 142: 400-406.

Enhancement of docosahexaenoic acid production in Schizochytrium sp.31 combining Ethylmethylsulfone and Atmospheric and Room Temperature Plasma treatment

ZHAO Ben1

WANG Wu1

LI Chang-ling2

YANG Hai-lin1

(1.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China; 2.College of Biological and Food Engineering, Huaihua University, Huaihua, Hunan 418000, China)

Abstract: For establishing an efficient and stable mutagenesis method on breeding Schizochytrium DHA higher producers, the wild-type strain named Schizochytrium sp.31 was mutated combining Ethylmethylsulfone (EMS) and Atmospheric and Room Temperature Plasma (ARTP) treatment.Mutagenic efficiency, fermentation indexes of the mutants were compared and analyzed.Under this compound mutagenesis method, the positive mutation rate reached 32.2%, which was much higher than that under other two single-factor mutagenesis methods.Besides, DHA production and DHA percentage in total fatty acids reached to 7.2 g/L and 43.2%, which were 35.6% and 19.2% higher than that of the wild-type strain, respectively.After five rounds of cell culture passages, mutants induced from compound mutagenesis method showed up with better genetic stability.This mutagenesis method was proved to be an efficient strategy of breeding Schizochytrium DHA higher producers.It also provideed references to the breeding practices on the algal higher producers for synthesizing other types of polyunsaturated fatty acids.

Keywords: Schizochytrium; docosahexaenoic acid; mutagenesis; atmospheric and room temperature plasma; ethyl methanesulfonate; compound mutagenesis

基金项目:国家“863”计划(编号:2014AA021702);江苏省2014年度普通高校研究生科研创新计划项目(编号:KYLX_1148);工业生物技术教育部重点实验室2016年度开放课题(编号:KLIB-KF201601);“111”计划(编号:111-2-06)

作者简介:赵犇,男,江南大学在读博士研究生。

通信作者:王武(1952—),女,江南大学教授,硕士。E-mail: wangwu@jiangnan.edu.cn

杨海麟(1971—),男,江南大学教授,博士。E-mail:19891996@sina.com

收稿日期:2017-12-10

DOI:10.13652/j.issn.1003-5788.2018.02.005